慢性乙型肝炎及乙型肝炎性肝硬化患者色氨酸代謝變化及其相關性分析

班艷娜，甄乾娜，鄧琳琳，何一帆，丁 敏△

(1.重慶醫科大學附屬第一醫院生殖健康與不孕癥專科實驗室 400016;2.重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌實驗室 400016;3.重慶醫科大學檢驗醫學院/臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室 400016)

論著·臨床研究

慢性乙型肝炎及乙型肝炎性肝硬化患者色氨酸代謝變化及其相關性分析

班艷娜1，甄乾娜2，鄧琳琳3，何一帆3，丁 敏3△

(1.重慶醫科大學附屬第一醫院生殖健康與不孕癥專科實驗室 400016;2.重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌實驗室 400016;3.重慶醫科大學檢驗醫學院/臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室 400016)

目的探討慢性乙型肝炎(CHB) 和乙型肝炎性肝硬化(HBC)患者色氨酸(Trp)代謝變化及相關性。方法選取2015年10月至2016年1月在重慶醫科大學附屬第一醫院住院的CHB 81例和HBC 40例患者為研究對象，40例健康者為對照。采用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FD)對各組受試者血漿中Trp及代謝產物犬尿氨酸(Kyn)、5-羥色胺(5-HT)水平進行測定，實時熒光定量PCR檢測HBV-DNA病毒復制數，分析3組間血清學指標差異，采用Pearson相關分析和Logistic回歸分析篩選危險因素。結果與對照組比較，CHB組、HBC組受試者血漿中Trp和5-HT水平明顯降低(Plt;0.01);HBC組受試者血漿中Kyn/Trp明顯高于其他兩組(Plt;0.01)。HBC組Kyn/Trp與A/G呈負相關(r=-0.686，Plt;0.01),CHB組Kyn/Trp與Log DNA呈正相關(r=0.784,Plt;0.01)。Logistic回歸分析顯示Kyn/Trp為CHB和HBC的危險因素。結論檢測血漿中Trp及其代謝產物可作為輔助指標評估乙型肝炎進展情況。

色氨酸；犬尿氨酸；5-羥色胺；乙型肝炎；乙型肝炎性肝硬化

我國約有2億人患有慢性乙型肝炎(CHB)，其中30%的患者會發展為乙型肝炎性肝硬化(HBC)[1]，甚至肝癌。研究表明，機體中乙型肝炎病毒介導的免疫耐受和病毒載量與吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)相關[2]。IDO可通過降解外周細胞中的色氨酸(Trp)生成犬尿氨酸(Kyn)及其衍生物，同時可經Trp加氧酶生成5-羥色胺(5-HT)[3]。有研究報道CHB患者中IDO高表達[4]，Trp在CHB和HBC患者中代謝變化尚不明確。本文探討CHB和HBC患者Trp代謝變化及其相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年10月至2016年1月在重慶醫科大學附屬第一醫院住院的CHB和HBC患者為研究對象。CHB組81例，男43例，女38例，平均年齡(45.89±12.60)歲；HBC組40例，男29例，女11例，平均年齡(46.05±12.52)歲；40例健康者為對照組，男21例，女19例，平均年齡(45.29±7.30)歲。納入標準：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[5];(2)既往有乙型肝炎病毒史或者HBsAg陽性超過6個月，現在HBsAg和HBV-DNA仍為陽性；(3)結合病史中影像學、生物學或者血清學檢查肝細胞合成障礙或者門靜脈高壓癥，或組織學符合肝硬化診斷。排除標準：(1)合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒重疊感染；(2)合并脂肪肝及酒精性肝病；(3)最近半年以來未接受抗病毒、免疫及精神癥狀治療；(4)合并嚴重心、腎、內分泌、其他自身免疫性疾病及血液系統疾病；(5)妊娠或哺乳期婦女。本研究經重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準(2013-24)，受試者均簽署知情同意書。

表1 3組受試者臨床資料及實驗室指標

-:此項無數據

圖1 各組受試者血漿中Trp及其代謝物水平比較

1.2方法

1.2.1儀器和試劑 Shimadzu 2010L高效液相色譜儀(日本Shimadzu 公司)，配紫外檢測器和Class-VP 色譜工作站；日立全自動分析儀 (RL7600-110)；實時熒光定量PCR(Roche cobas z480)；天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、清蛋白(Alb)、前蛋白(PA)和總蛋白(TP)檢測試劑和生化復合校準品(四川邁克生物科技股份有限公司)；標準品Kyn、Trp、5-HT均為色譜純(美國Sigma公司)。

1.2.2樣品采集與生化指標檢測 清晨空腹采血，分離血清，測定AST、ALT、PA、Alb、TP水平。采用實時熒光定量PCR進行HBV-DNA檢測(試劑盒由湖南圣湘生物科技有限公司提供)。同時用肝素抗凝管采取2 mL，于 4 ℃、2 000×g離心分離血漿，置于-20 ℃冰箱內保存，用于Trp及代謝產物的檢測。

1.2.3高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FD)[6]檢測血漿Trp、Kyn、5-HT水平 取血漿100 μL，加入15 μL內標溶液(300 μmol/L茶堿)和10 μL 35%高氯酸溶液，渦漩混勻1 min，15 000×g、4 ℃離心10 min，沉淀蛋白，取上清液25 μL進樣分析。色譜條件:色譜柱為BDS-Hypersil-C8柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為10 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)∶乙腈 (94∶6,v/v)，柱溫25 ℃，流速0.6 mL/min。紫外檢測程序波長為0～5.5 min,360 nm；5.6～6.0 min,220 nm；6.1～7.0 min,302 nm；7.1～8.0 min,360 nm。該方法日內相對標準偏差0.80%～3.45%,日間相對標準偏差1.21%～14.89%。平均回收率87%～113%。

2 結 果

2.1臨床資料及實驗室指標 3組受試者年齡和性別比較差異無統計學意義(Pgt;0.05)，AST、ALT、PA、Alb、TP、A/G在兩組間比較差異均有統計學意義(Plt;0.05)。見表1。

2.2各組受試者Trp及其代謝分析 CHB組和HBC組受試者血漿中5-HT和Trp水平低于對照組(Plt;0.01)；HBC組受試者血漿中Kyn/Trp較其他兩組明顯升高(Plt;0.01)。見圖1。

2.3線性逐步回歸及相關性分析 在CHB組中，以5-HT、Kyn和Trp為自變量，HBV-DNA為因變量進行線性逐步回歸分析，僅Trp和Kyn進入方程，相關系數0.833，回歸方程：Y=5.377-0.156X1(Trp)+4.228X2(Kyn),F=55.19,P=0.000。HBC組Trp、Kyn和5-HT(自變量)與A/G(因變量)進行線性逐步回歸分析,結果顯示僅Trp和Kyn進入方程，相關系數0.784,回歸方程：Y=0.092+0.030X1(Trp)-0.612X2(Kyn),F=15.74,P=0.000。Person相關分析顯示：CHB組中Kyn/Trp與Log DNA呈正相關(r=0.784,Plt;0.01),在HBC組中Kyn/Trp與A/G呈負相關(r=-0.686,Plt;0.01)。見圖2。

2.4危險因素的單因素分析 對可能影響CHB和HBC的5-HT、Kyn、Trp和Kyn/Trp危險因素進行單因素分析，以是否患有CHB或HBC為因變量，分別以5-HT、Trp、Kyn和Kyn/Trp為自變量，進行二元Logistic回歸分析。結果顯示兩組間5-HT、Trp、Kyn/Trp均有特異性差異(Plt;0.05)。Kyn/Trp為CHB和HBC患者的獨立危險因素。見表2。

A：HBC組Kyn/Trp與A/G相關性；B：CHB組Kyn/Trp與Log DNA相關性

圖2 線性逐步回歸及相關性分析表2 CHB和HBC患者危險因素單因素分析

3 討 論

乙型肝炎病毒入侵肝細胞后，其本身并不直接引起肝細胞病變，而是其在肝細胞內復制并激發人體的免疫系統，這種肝細胞內的免疫反應可對肝細胞造成損傷和破壞。文獻報道，HBC患者中IDO高表達引起Trp降解和抑制機體T細胞,Kyn/Trp間接反映出IDO的活性[4]。本研究結果顯示CHB組Kyn/Trp與Log DNA呈正相關(r=0.784),表明乙型肝炎病毒載量可與機體的免疫機制有關。乙型肝炎病毒入侵后，在機體的免疫系統調節下，病毒暫時減緩或停止復制,免疫反應就會較弱或停止,對肝細胞的損害也就相應較輕,血清中HBV-DNA水平及轉氨酶維持在較低或正常水平,但在某些誘因下,平衡條件改變,病毒在宿主體內活動活躍,此時宿主的細胞免疫和體液免疫應答加強[7],以攻擊患者肝細胞內的大量病毒,肝細胞也隨之受到損害。因此，ALT/AST僅僅反映肝細胞受損情況，與機體的免疫調節無關，而Kyn/Trp更能確切地反映出機體的免疫狀態。

IDO通常被認為是免疫激活指示器，參與腫瘤免疫耐受，尤其在全身免疫耐受中起著至關重要的作用。文獻報道，CHB感染后會促進IDO的高表達[8-9]。實驗表明，乙型肝炎病毒感染后巨噬細胞在γ-干擾素(IFN-γ)及來自活化T細胞的誘導下可以表達IDO[10]，在Trp缺乏的環境下T細胞將無法活化與克隆增殖，而且這種T細胞增殖一旦被抑制將很難被再次激活，從而IDO上調可能會促使丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒逃避T細胞免疫。本試驗結果顯示，與對照組相比，CHB組和HBC組受試者Trp、Kyn水平都發生了變化。HBC患者中Kyn/Trp比CHB組更高。由此可以看出，Trp代謝在乙型肝炎病毒介導的肝臟疾病中發生了變化，這種變化可能與乙型肝炎病毒介導的免疫耐受有關。

乙型肝炎病毒感染機體后，通過免疫系統激活T細胞分泌IFN-γ及細胞毒性T細胞來保護肝細胞受損，但IFN-γ分泌會激活IDO活性來削弱抗原提呈細胞的功能，從而使T細胞功能喪失[11-12]。同時Trp降解產生的代謝產物Kyn也可以直接抑制T細胞功能，誘導正經歷活化階段的T細胞凋亡。這樣的作用會導致機體處于免疫抑制狀態，造成肝臟功能嚴重障礙。本研究顯示，HBC患者Kyn/Trp與A/G呈負相關(r=-0.686)，說明HBC患者激活的IDO加速Trp代謝降解，Kyn/Trp增大，導致肝臟免疫功能抑制更嚴重，肝臟合成清蛋白功能減弱，球蛋白代償性的增加，A/G倒置。

目前IDO在多種腫瘤中高表達，IDO誘導腫瘤免疫耐受機制的研究表明，主要抑制T細胞增殖達到逃避免疫監視的目的，從而促使腫瘤細胞增殖和侵襲轉移[13]。HBC組Trp水平明顯低于CHB組，Kyn/Trp高于CHB組，并且Logistic回歸分析顯示Kyn/Trp均為CHB和HBC的危險因素。因此對這兩種疾病的患者評估Kyn/Trp 相當重要。同時也說明乙型肝炎病毒感染引起機體免疫損傷HBC組比CHB組更嚴重，從而出現兩組Kyn/Trp特異性差異，HBC患者中Kyn/Trp反映IDO處于高表達狀態，也可以提示患有腫瘤的風險。

5-HT是一種調節心情變化的神經遞質，腦脊液中5-HT水平降低會引起抑郁癥。有研究發現，肝硬化患者有較高的比例患有抑郁傾向，抑郁癥嚴重性與肝臟損壞程度相關[14]。本試驗結果顯示，CHB和HBC患者5-HT的水平與對照組比較均顯著性降低，表明5-HT與HBV患者抑郁癥狀有關，這一結果與文獻報道一致[15]。

綜上所述，Trp及代謝物在CHB和HBC患者中發生了顯著性變化，并且Kyn/Trp在這兩種疾病中均為危險因素，檢測Trp及其代謝物可能成為一個新的評估乙型肝炎進展的潛在輔助指標。

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TryptophanmetabolismchangeinpatientswithchronichepatitisBandhepatitisBcirrhosisanditscorrelationanalysis*

BanYanna1,ZhenQianna2,DengLinlin3,HeYifan3,DingMin3△

(1.LaboratoryofHealthReproductionandInfertility;2.DepartmentofEndocrinologyLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;3.KeyLaboratoryofDiagnosticMedicineofMinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo investigate the tryptophan (Trp) metabolism change in the patients with chronic hepatitis B (CHB) and hepatitis B cirrhosis (HBC) and to analyze the related risk.MethodsEighty-one cases of CHB and 40 cases of HBC hospitalized in the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University from October 2015 to January 2016 served as the study subjects,and 40 healthy persons as the controls.High performance liquid chromatography -fluorescence detection (HPLC-FD) were adopted to detect the levels of plasma Trp,kynurenine (Kyp) and its metabolite 5-hydroxy tryptamine (5-HT).HBV-DNA viral replication number was detected by real-time quantitative PCR.The serological indicators differences among 3 groups were analyzed.The risk factors were analyzed and screened by the Logistic regression analysis and Pearson correlation analysis.ResultsCompared with the control group,plasma 5-HT and Trp levels in the CHB group and HBC group were significantly decreased(Plt;0.01);plasma Kyn/Trp in the HBC group was significantly higher than that in the other two groups(Plt;0.01).Kyn/Trp in the HBC group was negatively correlated with A/G (r=-0.686，Plt;0.01),and Kyn/Trp in the CHB group was positively correlated with Log DNA (r=0.784,Plt;0.01).The Logistic regression analysis indicated that Kyn/Trp was the risk factor of CHB and HBC.ConclusionDetecting plasma Trp and its metabolite can serve as the adjuvant indicators for assessing the progression of hepatitis B.

tryptophan;kynurenine;5-hydroxy tryptamine;chronic hepatitis B;hepatitis B cirrhosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.005

國家自然科學基金資助項目(81200294)。

班艷娜(1986-)，初級檢驗技師，碩士，主要從事分析化學研究。△

,E-mail：dingmin@cqmu.edu.com。

R-33

A

1671-8348(2017)33-4622-03

2017-05-10

2017-07-17)