Wip1基因重組慢病毒表達載體的構建及其對乳腺癌MCF-7細胞生物學行為的影響研究

李宗濤，顧笑梅，孫國貴，李 娟，張 浩

(1.河北省唐山市工人醫院乳腺外科 063000；2.河北省唐山市婦幼保健院婦產科 063000；3.河北省唐山市人民醫院放化療科 063000)

·論著·

Wip1基因重組慢病毒表達載體的構建及其對乳腺癌MCF-7細胞生物學行為的影響研究

李宗濤1，顧笑梅2，孫國貴3，李 娟2，張 浩2

(1.河北省唐山市工人醫院乳腺外科 063000；2.河北省唐山市婦幼保健院婦產科 063000；3.河北省唐山市人民醫院放化療科 063000)

目的構建Wip1基因重組慢病毒表達載體，研究其對乳腺癌細胞生物學行為的影響。方法以慢病毒感染方法將Wip 1的短發夾狀RNA(shRNA)轉入乳腺癌MCF-7細胞。采用qRT-PCR和蛋白質印跡法(Western blot)檢測轉染前后細胞Wip1 mRNA、蛋白的表達，MTT法、流式細胞術及Transwell侵襲實驗檢測Wip1-shRNA對MCF-7細胞增殖、凋亡、周期及侵襲轉移的影響。篩選具有抑制 p53基因表達的干擾RNA分子p53dsRNA,并分析其干擾后對乳腺癌MCF-7細胞侵襲轉移的影響。結果轉染48 h后，Wip1-shRNA組細胞熒光較強，NC-shRNA組較弱。Wip1-shRNA組細胞Wip1 mRNA和蛋白的表達分別為0.291±0.025、0.203±0.021與NC-shRNA組0.954±0.090、0.963±0.092比較，差異有統計學意義(Plt;0.05)。兩組各時間點細胞存活率比較，差異有統計學意義(Plt;0.05)。NC-shRNA組早期與晚期細胞的凋亡數少于Wip1-shRNA組，差異有統計學意義(Plt;0.05)。NC-shRNA組細胞G0+G1期、S期細胞數分別為53.5±3.6、27.3±1.5，Wip1-shRNA組分別為72.3±5.2、14.6±0.8,差異有統計學意義(Plt;0.05)。Transwell侵襲轉移結果表明，NC-shRNA組細胞的穿膜數均多于Wip1-shRNA組(Plt;0.05)。對照組細胞中p53 mRNA的表達、細胞侵襲轉移的穿膜數與p53dsRNA組比較，差異有統計學意義(Plt;0.05)。結論RNA干擾可有效抑制乳腺癌MCF-7細胞Wip1表達,Wip1可能通過調控蛋白表達影響乳腺癌細胞增殖、凋亡、周期與侵襲轉移，p53dsRNA干擾p53 基因下調后增加乳腺癌MCF-7細胞侵襲轉移的能力。

Wip1；乳腺腫瘤；細胞凋亡；基因轉染

慢病毒屬逆轉錄病毒科，是以HIV-1為基礎發展起來的基因治療載體。其能夠在人和動物的細胞系或原代細胞中高效地導入目的基因或者RNA干擾，效果維系時間長并且很穩定，可以在宿主細胞中成功整合目的基因，目的基因隨著機體細胞進行分裂增殖，還可以對非分裂的細胞進行整合。

全球每年新增乳腺癌患者120萬，每年死亡人數約50萬人，我國主要城市近10來發病率增長了37%。目前，乳腺癌目前已成為嚴重威脅婦女健康的第一大殺手，其早期診斷、惡性程度分析及預后判斷是當今研究的熱點。

本文采用慢病毒感染方法將Wip1的短發夾狀RNA(shRNA)轉入乳腺癌MCF-7細胞，采用qRT-PCR和蛋白質印跡法(Western blot)檢測轉染前后細胞Wip1 mRNA、蛋白的表達，MTT法、流式細胞術及Transwell侵襲實驗檢測Wip1-shRNA對MCF-7細胞增殖、凋亡、周期及侵襲轉移的影響，給臨床治療乳腺癌及預后的判斷帶來新的可能。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 乳腺癌MCF-7細胞購自中科院腫瘤醫院細胞庫；以pLenti.puro-shWip1-eGFP為質粒和載體，針對Wip1對shRNA干擾的慢病毒重組質粒予以構建，并實現Wip1-shRNA及陰性對照shRNA(NC-shRNA)慢病毒的包裝；病毒載體購自廣州賽業生物科技有限公司，引物設計及合成由上海生工生物工程技術服務有限公司提供。qRT-PCR試劑盒購自北京索來寶公司；兔抗人單克隆抗體Wip1、p53購自美國Abcam公司；p53dsRNA合成由廣州銳博生物有限公司提供。

1.2方法

1.2．1細胞培養與慢病毒感染 感染前1 d將乳腺癌MCF-7細胞以每孔105個接種于24孔板中，待細胞生長達80%范圍時把慢病毒稀釋液(含NC-shRNA或Wip1-shRNA質粒)1 mL加入。在感染病毒12 h之后，把病毒液吸去并將DMEM培養基1 mL加入予以繼續培養。感染病毒48 h之后，對帶有綠色熒光的細胞在熒光顯微鏡下加以挑取，從而克隆擴大培養。實驗分為空轉染組(NC-shRNA組)、轉染組(Wip1-shRNA組)。

1.2.2RNA提取與qRT-PCR Wip1按Trizol試劑說明提取細胞總RNA，根據qRT-PCR試劑盒說明逆轉錄成cDNA，進行PCR擴增。Wip1上游引物：5′-TTC CCC ATG TTC TAC ACC ACC AG-3′，下游引物：5′-TGA GGG TAT GAC TAC ACC TTG GAC-3′；GAPDH上游引物：5′-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3′，下游引物：5′-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CC-3′。 PCR反應條件：95 ℃預變性60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸45 s，40個循環。利用瓊脂糖凝膠電泳成像系統成像，表達量以Wip1和GAPDH電泳條帶灰度比值表示。

1.2.3Western blot 提取轉染前后細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳實現蛋白的分離，進行固相支持體(聚偏氟乙烯膜)室溫封閉蛋白質1 h，分別與Wip1抗體、p53抗體和GAPDH抗體 (稀釋均為1∶500) 反應過夜(4 ℃)，熒光二抗(稀釋1∶2 000)進行1 h室溫孵育。掃描顯像由紅外激光成像系統實現，表達量通過目的條帶與GAPDH條帶灰度比值表示。

1.2.4MTT法 取處于對數生長期接種密度70%～80% NC-shRNA組、Wip1-shRNA組細胞按每孔5 000個細胞、每孔體積200 μL在96孔培養板內予以接種。終止培養時間為24、48、72、96 h。5 mg/mL MTT溶液20 μL在培養終止前4 h加入,繼續培養4 h，除去培養基，每孔加入200 μL DMSO,予以振蕩直到結晶溶解為止。利用全自動酶標儀檢測各孔吸光度(A)值，490 nm為其檢測波長，620 nm為其參考波長。細胞存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.5細胞凋亡、周期實驗 細胞凋亡：選擇對數生長期接種密度70%～80% NC-shRNA組、Wip1-shRNA組細胞。 把細胞消化、收集，用預冷的4 ℃磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，以1 mL結合緩沖液將細胞重新懸浮，濃度每毫升1×106,在5 mL流式管中加入100 μL細胞懸液，每管加入10 μL碘化丙啶，并進行15 min的均勻避光。細胞周期：取處于對數生長期接種密度70%～80%NC-shRNA組、Wip1-shRNA組細胞。將細胞消化、收集，用預冷的4 ℃ PBS沖洗2次，使其濃度為每毫升1×106,在5 mL流式管中加入195 μL的細胞懸液，每管加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 的10 μL碘化丙啶，并進行15 min的均勻避光。采用流式細胞儀上機檢測。

1.2.6Transwell侵襲實驗 聚碳酸脂微孔濾膜上鋪Matrigel凝膠(8.4 g/L) 50 μL或無Matrigel凝膠聚碳酸脂微孔濾膜，NC-shRNA組、Wip1-shRNA組細胞均以無血清培養基制成細胞懸液(每毫升1×106個)；各取50 μL 在小室進行移入，800 μL 10% DMEM完全培養基在下室加入；培養18 h后，用棉簽把濾膜上室面的細胞刮除，在下室面的細胞實現侵襲并黏附，使用4%多聚甲醛固定，進行20 min 0.1%結晶紫的染色。每張膜中央部分和周圍部分各隨機取5個視野,計數每個視野內的穿過8 μm微孔的細胞數。腫瘤細胞的侵襲能力用每個視野的平均數表示。

1.2.7p53dsRNA沉默效應的鑒定 在 p53dsRNA 中篩選出能夠沉默基因且效應最強的一個siRNA序列用于之后共轉染的實驗。將p53dsRNA稀釋后與 Lipofectamine2000試劑混合，形成siRNA/Lipofectamine2000復合物，再將轉染復合物加入到乳腺癌MCF-7細胞與Opi-MEM培養液的培養板中，siRNA濃度為50 nmol,總體積為2 mL。6 h后換含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養液繼續培養，48 h后提取總RNA，行qRT-PCR 觀察p53沉默效應。

2 結 果

2.1慢病毒感染篩選穩定表達細胞株及其對細胞Wip1 mRNA和蛋白的表達影響 轉染48 h后，Wip1-shRNA組細胞轉染率都在85%以上，熒光較強；NC-shRNA組細胞轉染率只有20%左右，熒光較弱，見圖1。Wip1-shRNA組細胞Wip1 mRNA和蛋白表達分別為0.291±0.025、0.203±0.021與NC-shRNA組0.954±0.090、 0.963±0.092比較，差異有統計學意義(Plt;0.05)。

2.2Wip1-shRNA對乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡、周期、侵襲轉移的影響 兩組各時間點細胞存活率比較，差異有統計學意義(Plt;0.05)，見圖2。NC-shRNA組早期與晚期細胞的凋亡數為(5.4±0.6)%，Wip1-shRNA組為(17.6±0.9)%，差異有統計學意義(Plt;0.05)，見圖3。NC-shRNA組細胞G0+G1期、S期細胞數分別為53.5±3.6、27.3±1.5，Wip1-shRNA組分別為72.3±5.2、14.6±0.8,差異有統計學意義(Plt;0.05)，見圖4。Transwell侵襲結果表明，NC-shRNA組細胞的穿膜數為106.0±11.0，Wip1-shRNA組為49.0±6.0，差異有統計學意義(Plt;0.05)；Transwell轉移結果表明，NC-shRNA組細胞的穿膜數為96.0±9.0，Wip1-shRNA組為42.0±4.01，差異有統計學意義(Plt;0.05)，見圖5。

A：NC-shRNA組；B：Wip1-shRNA組

圖1兩組轉染情況(熒光×100)

圖2 Wip1-shRNA對乳腺癌MCF-7細胞存活率的影響

A：NC-shRNA組；B：Wip1-shRNA組

圖3流式細胞術檢測乳腺癌MCF-7細胞凋亡情況

A：NC-shRNA組；B：Wip1-shRNA組

圖4流式細胞術檢測乳腺癌MCF-7細胞周期情況

2.3Wip1-shRNA對乳腺癌MCF-7細胞p53蛋白的表達影響 NC-shRNA組細胞中p53蛋白表達的相對表達量為0.765±0.067，Wip1-shRNA組為0.315±0.033，差異有統計學意義(Plt;0.05)。見圖6。

圖5 Transwell檢測乳腺癌MCF-7細胞侵襲轉移情況(×100)

圖6 Western blot檢測乳腺癌MCF-7細胞 p53蛋白的表達

圖7 p53dsRNA對乳腺癌MCF-7細胞侵襲轉移的影響(×200)

2.4p53dsRNA對乳腺癌MCF-7細胞p53mRNA表達及侵襲轉移的影響 對照組、p53dsRNA組細胞p53 mRNA的相對表達量分別為0.663±0.047、0.190±0.013，差異有統計學意義(Plt;0.05)；對照組細胞侵襲轉移的穿膜數分別為135.0±14.0、104.0±9.0，p53dsRNA組分別為155.0±16.0、108.0±7.0，差異有統計學意義(Plt;0.05)。見圖7。

3 討 論

Wip1與Wild-type-53密切相關，受到Wild-p53的誘導，參與到DNA的損傷修復過程中，并發揮重要的作用[1]。Wip1在人類卵巢癌、乳腺癌、髓母細胞瘤和神經母細胞瘤中都有較高的表達水平[2]。主要定位于17號染色體，參與腫瘤細胞增殖、分化、抗凋亡等過程。對于Wip1來說，它能夠實現抑癌基因的抑制，導致癌癥的發生，并和多種原癌基因具有協同作用[3]。有研究顯示，Wip1能夠脫磷酸化H2AX并使檢測點修復得到促進，加大腫瘤細胞的增殖速度[4]。除此之外，從某種程度來說腫瘤發生、發展受到Wip1同NF-κB、BRCA1-IRIS[5]基因相互作用，并且在各種腫瘤中Wip1的高表達，對p53起負回饋調控作用可以通過p38MAPK/p53信號通路來實現[6]，同時具備誘導p53突變等特點[7]。以Wip1為靶點的基因治療研究開始列入人們的計劃，利用RNA基因干擾技術沉默髓母細胞瘤D283細胞實現Wip1的高表達，增高了p53的表達水平，使腫瘤細胞凋亡得到誘導[2]。對于其介導的基因來說，其表達作用具備持續且穩定的特點，在宿主細胞基因組中目的基因能實現整合，同時它的分裂隨細胞基因組的分裂同時進行[8]。

對于慢病毒來說，它屬于逆轉錄病毒科亞科的一種，屬于RNA病毒的范疇，逆轉錄病毒的特性明顯，基因組在經逆轉錄后可以在宿主DNA上整合，其增殖隨宿主細胞的增殖而進行，另外具備使非分裂細胞感染、轉移基因片段容量大、持續性強目的基因表達、宿主免疫反應不易誘發等優點[9]。目前，在真核系統基因轉移慢病毒載體方面，它作為工具已經備受青睞[9]。跟傳統的逆轉錄病毒載體相比，慢性病毒載體具有整合基因不發生重排及高感染率等優點[1]，另外其高效轉錄、宿主范圍廣、高效表達及高效整合的特點也值得關注。它不僅可以對分裂和非分裂細胞感染，同時對于靜止細胞還能夠實現感染[10]。在進行改構之后，寄主細胞的死亡或者在宿主內增殖的情況都不會出現，細胞在感染和轉化后可以實現傳代增殖[11]。因此利用慢病毒作載體，將動物細胞的基因型改變，并遺傳到子代，成為生物領域干預基因實驗的重要方法[12]。

本研究顯示，慢病毒載體可以對Wip1 mRNA、蛋白的表達起到有效地抑制，同時可以使細胞周期的變化得到明顯改變，細胞生長也會因此受到抑制。且p53dsRNA對MCF-7細胞p53 mRNA表達及侵襲轉移也能產生影響。相關研究顯示：對于Wip1 shRNA慢病毒載體來說，它對于MCF-7細胞內Wip1的表達水平可以做到有效沉默，同時也會抑制乳腺癌細胞惡性增殖的特性[13]。有研究顯示，Wip1的基因沉默明顯抑制了乳腺癌細胞的遷移及侵襲能力，進一步為Wip1在乳腺癌組織中表達規律及其是否參與乳腺癌的發生、發展均有積極的指導作用，為腫瘤新的靶向治療提供了理論依據。Parssinen等[11]研究中曾有相關報道。

Wip1 shRNA慢病毒載體可以做到有效沉默，同時在抑制細胞惡性增殖方面效果明顯。在惡性腫瘤的研究中，Wip1 RNA干預技術是乳腺癌靶向治療的新技術，是腫瘤治療方面研究的重點。

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ConstructionofWip1generecombinantlentiviralexpressionvectoranditseffectsonbreastcancerMCF-7cellbiologicalbehavior*

LiZongtao1,GuXiaomei2,SunGuogui3,LiJuan2,ZhangHao2

(1.DepartmentofBreastSurgery,TangshanMunicipalWorker′sHospital,Tangshan,Hebei063000,China;2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,TangshanMunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,Tangshan,Hebei063000,China;3.TangshanMunicipalPeople′sHospital,Tangshan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo construct the Wip1 gene recombinant lentiviral expression vector and to investigate its effects on breast cancer cell biological behaviors.MethodsWip1 gene short hairpin RNAs (shRNA) was transfected into breast cancer MCF-7 cells through lentiviral infection method.Wip1 mRNA and protein expressions before and after transfection were detected by using qRT-PCR and Western blotting.The effects of Wip1-shRNA on the proliferation,apoptosis,cell cycle,invasion and metastasis in MCF-7 cells were determined by using the MTT assay,flow cytometry and transwell invasion test.Interfering RNA molecule p53dsRNA inhibiting p53 gene expression (p53 dsRNA) was screened,and the effect of p53 inhibition on MCF-7 cells invasion and metastasis was analyzed.ResultsAfter transfection for 48 h,the cellular fluorescence in the Wip1-shRNA group was stronger,while which in the NC-shRNA group was weaker.Cellular Wip1 mRNA and protein expressions in the Wip1 shRNA group were 0.291±0.025 and 0.203±0.021 respectively,which in the NC-shRNA group were 0.954±0.090 and 0.963±0.092 respectively,the difference between the two groups was statistically significant(Plt;0.05).The cellular survival rate at various time points had statistical difference between the two groups(Plt;0.05).The early and late cell apoptosis number in the NC-shRNA group was less than that in the Wip1-shRNA group,the difference was statistically significant(Plt;0.05).The cells numbers at phase G0+G1and phase S in the NC-shRNA group were 53.5±3.6 and 27.3±1.5 respectively,which in the Wip-shRNA group were 72.3±5.2 and 14.6±0.8 respectively,the difference was statistically significant(Plt;0.05).The Transwell invasion and metastasis results showed that the cell transmembrane number in the NC-shRNA group was more than that in the Wip1-shRNA group(Plt;0.05).The cellular p53 mRNA and protein expression had statistical difference between the control group and p53dsRNA group(Plt;0.05).ConclusionRNA interference can effectively suppress Wip1 expression in MCF-7 cells.Wip1 may affect the proliferation,apoptosis,cell cycle,invasion and metastasis of breast cancer cells by modulating protein expression.p53dsRNA increases the invasion and metastasis ability of breast cancer MCF-7 cells by interfering p53 gene down-regulation.

Wip1;breast neoplasms;apoptosis;gene silencing

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.001

2015年度河北省醫學科研重點課題計劃(20150953)。

李宗濤(1978-)，副主任醫師，博士，主要從事乳腺癌及各種乳腺良性疾病的診斷、治療研究。

R73

A

1671-8348(2017)33-4609-04

2017-05-18

2017-07-26)