水下爆炸致兔急性肺損傷的實驗研究

王前進，葉長青，邵先安，徐長江，黃奕江，馬宏昊，郝 建，齊曉林

·短篇論著·

水下爆炸致兔急性肺損傷的實驗研究

王前進，葉長青，邵先安，徐長江，黃奕江，馬宏昊，郝 建，齊曉林

目的構建水下爆炸致急性肺損傷動物模型，研究致傷機制，分析早期死亡原因，為臨床診治水下急性肺損傷提供實驗數據。方法選擇新西蘭兔30只，雌雄不限，質量(2.04±0.35)kg；隨機分為實驗組、對照組兩組，每組15只。實驗組爆炸源與致傷動物的距離為1.8m，對照組不做爆炸。傷后0、4、12、24h采集血液，24h放血處死，采集支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織標本，測定肺濕干重比(W/D)，測量傷后0、4、12、24h呼吸頻率，并行血氣分析，酶聯免疫吸附測定(ELISA)方法測定血液、BALF中白細胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)，光鏡下觀察肺HE染色切片病理學變化。結果實驗組傷后0、4h呼吸頻率較對照組增快(P<0.05)，傷后24h PaO2低于對照組(P<0.05)；實驗組血液及BALF中IL-8、TNF-α均較對照組升高(P<0.05)，實驗組W/D也明顯高于對照組(P<0.05)；光鏡下見肺泡結構破壞，肺間質及肺泡腔水腫、出血，粒細胞浸潤。結論實驗組能較好地模擬水下爆炸肺損傷特點，結果重復性好，能作為水下爆炸肺損傷的動物模型。

肺損傷； 水下爆炸； 動物模型

爆炸性武器在水下爆炸，產生強烈沖擊波，造成水下沖擊傷。肺是水下沖擊波致傷和致死的“靶器官”[1]。急性肺損傷(ALI)若不及時救治，可導致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，是早期死亡原因之一。本研究利用中國科技大學研制的爆炸裝置，建立新西蘭兔急性肺損傷模型，研究水下肺損傷致傷機制，分析早期死亡原因，為臨床診治水下急性肺損傷提供實驗數據。

材料與方法

1實驗材料

實驗動物為30只健康新西蘭兔，雌雄不限，質量(2.04±0.35)kg，由安徽長臨河醫藥科技有限公司提供[許可證號syxk(皖)2007-002]，均按標準條件飼養。血氣分析采用美艾利爾Epoc?血氣分析系統；兔白細胞介素8(IL-8)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號：201602)；兔腫瘤壞死因子-a (TNF-α) ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號：201602)。

2爆炸裝置

爆炸源為太安炸藥，壓力數據測試系統包括安捷倫示波器(型號dso5054A)，水下壓力傳感器為pcb138A25(由中國科學技術大學近代力學系爆炸實驗室提供)，見圖1。

3實驗方法

3.1實驗分組 將30只新西蘭兔隨機分為實驗組、對照組，每組15只，根據預實驗結果，實驗組爆炸源與致傷動物的距離為1.8m。

3.2模型建立 實驗組兔氯胺酮40mg/kg,氟哌利多1.6 mg/kg，經肌肉注射麻醉[2]，胸部及頸部備皮，分別經左頸總動脈和右頸外靜脈放置留置針，將兔固定在自制鋼質保護箱中，保護箱在兔胸部處開一窗口，窗口大小與兔胸部一致，且可調節(圖2)。兔頭部外露，其余部位如腹部、四肢等均保護在箱體內，將保護箱放置于水下爆炸罐內并固定(圖3)。爆炸源采用太安炸藥1g，制成圓柱狀藥包，炸藥采用導爆管起爆，同時保證新西蘭兔胸部中心與水下壓力傳感器位于同一水平線上。測量超壓為(2.91±0.35)MPa，持續時間為(4.34±1.04)μs(壓力時程曲線見圖4)。爆炸實驗操作全部由專業人員實施[3]。

圖2自制鋼質保護箱圖3 兔保護箱固定于水下爆炸罐內

圖4 水下爆炸壓力時程曲線

4標本采集

經左頸總動脈留置針，各組分別采集傷后0、4、12、24h的頸總動脈血行血氣分析，并采集以上時間點頸總動脈血離心，分離血清備用。傷后24h放血處死實驗兔。夾閉左主支氣管，0.9%氯化鈉10mL反復3次灌洗右肺，抽取支氣管肺泡灌洗液(BALF)離心備用。取左肺下葉，吸干表面雜質，測干濕重。左肺上葉下部經0.9%氯化鈉沖洗，10%甲醛固定。

5觀察指標

(1) 呼吸頻率:記錄實驗組爆炸后0、4、12、24h呼吸頻率，同時記錄對照組相應時間點呼吸頻率。(2) 動脈血氣分析：經左頸總動脈留置管采動脈血2mL，即刻行血氣分析。(3)細胞因子濃度測定：頸總動脈血離心取血清，右肺BALF，ELISA方法分別測定IL-8、 TNF-α的濃度，試驗步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。(4)肺組織病理組織學觀察：左肺上葉下部經0.9%氯化鈉沖洗，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片4～5μm厚，HE染色，光鏡下由2名有經驗的病理醫生分別獨立觀察。(5)濕干比(W/D)：取左肺下葉，吸干表面雜質，天平稱取肺濕重后，置于80℃烘箱72h至烘干，稱取干重，計算肺濕干重比(W/D)。

6統計學分析

結 果

1兩組呼吸頻率比較

爆炸組傷后0h呼吸頻率明顯增快，4h仍呼吸急促，較對照組差異有統計學意義(P<0.05)。12h后呼吸逐漸平穩，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組呼吸頻率比較(次

與對照組相比:*P<0.05

2兩組動脈PaO2比較

傷后0h，實驗組PaO2升高明顯，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；傷后4、12h PaO2降低，與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；傷后24h,PaO2低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組動脈PaO2比較

與對照組相比：*P<0.05

3兩組血清細胞因子比較

實驗組傷后4、12、24h血清IL-8、TNF-α均明顯升高，與對照組相比，差異顯著(P<0.05)。見表3。

4兩組BALF細胞因子和濕干比(W/D)比較

實驗組傷后12、24h BALF中細胞因子濃度明顯升高，與對照組相比，差異顯著(P<0.05)。實驗組W/D升高，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 兩組血清細胞因子比較

與對照組相比：*P<0.05

表4 兩組支氣管灌洗液細胞因子和W/D比較

與對照組相比：*P<0.05

5病理變化

實驗組有3只兔兩肺見3葉以上的肺組織大片狀出血，累及肺實質，切面可見粉紅色泡沫狀的水腫液溢出，平均肺組織出血實變面積達80%以上，部分肺組織出現肺大泡和肺不張(圖5)。另12只兔見2葉以上肺組織小片狀出血，肺表面較膨滿，切面見支氣管腔內有少許泡沫樣液體(圖6)。光鏡下見雙側肺泡結構破壞，肺泡壁斷裂破碎，肺間質及肺泡腔水腫、出血，粒細胞浸潤，間質毛細血管內血流淤滯(圖7、8)。

圖5 重度肺損傷圖6 中度肺損傷

圖7 重度肺損傷(HE ×100)圖8 中度肺損傷(HE ×100)

討 論

動物模型是研究水下爆炸沖擊傷的基礎，目前有兩種方法制作模型：(1)利用激波管產生的沖擊波進行沖擊傷實驗研究[4]；(2)采用現場水下爆炸動物實驗法，將實驗動物靜脈麻醉后，頸部固定于距爆心一定距離的漂浮夾具，頭露出水面，胸腹部及四肢垂直并浸沒于水中[5]。筆者利用中國科技大學研制的爆炸裝置，采用現場靜爆方法，通過調整爆炸源和實驗兔的距離來控制致傷參數，建立了水下爆炸傷實驗模型。本實驗采用圓柱狀炸藥作為爆炸源，爆炸球具有裝藥量穩定、爆炸參數明確、爆炸能量可控制等優點。實驗兔固定在自制鋼質保護箱中，頭部外露，減少了沖擊波對其他臟器影響，實驗模型更加穩定。

肺是水下爆炸沖擊傷最易受損的器官，其病變程度與動物所承受的超壓大小及距爆心的距離有密切關系，相同爆炸劑量時，距爆心越近損傷越重[5]。筆者根據爆炸源與致傷動物不同的距離，分組進行預實驗，12只新西蘭兔隨機分成2組，每組6只，1組距離1.5m，1組距離1.8m，1.5m組24h只有2只存活，死亡率高，不適合作為實驗模型；而1.8m組早期只有1只死亡，傷后呼吸頻率、血氣、細胞因子變化明顯，病理見肺組織充血水腫，部分肺泡間隔內出血，可見中性粒細胞浸潤或聚集，能夠反映水下爆炸肺損傷的傷情變化特點。因此在后續實驗中，筆者選取1.8m作為爆炸距離。

急性肺損傷實驗動物建模并沒有公認的標準，以前不少研究者建模時參考1994年歐美聯盟協會根據臨床病例統計分析提出的ALI/ARDS診斷標準[6]，當氧合指數(PaO2/FiO2)≤300mmHg，即可診斷急性肺損傷。但Matute-Bello等[7]認為這一標準直接應用于判斷急性肺損傷實驗動物傷情并不合理，它只能在一定程度上反映出實驗動物肺損傷的程度。動物的PaO2與人差別較大，本實驗對照組新西蘭兔的PaO2為(82.57±7.03)mmHg，與文獻報道相似[8]。實驗組傷后0h PaO2升高明顯，是實驗兔呼吸頻率增加所致[9]，傷后24h PaO2降低，但氧合指數>300mmHg。筆者認為，肺損傷實驗動物模型應根據呼吸頻率、血清和BALF中細胞因子濃度的變化、肺含水量等評估，更重要的是組織病理學改變應符合肺損傷標準。利用中國科技大學研制的爆炸裝置，采用圓柱狀炸藥作為爆炸源，選用爆炸源距離致傷動物1.8m作為致傷參數建立實驗模型，能較好地模擬水下爆炸肺損傷，且致傷參數容易控制，復制簡單，可以進一步應用于水下爆炸傷的臨床救治實驗研究。

水下爆炸肺損傷分為原發性損傷和繼發性損傷。原發性損傷是沖擊波直接作用于胸部造成的損傷，肺部沖擊傷分5度[10]，Ⅰ度(無傷):肺臟表面和切面未見異常,或表面僅有輕微充血或個別點狀出血；Ⅱ度(輕度):一葉或數葉有點灶狀或有2個以內的斑塊狀出血，切面擠壓時有很少量粉紅色或血性泡沫樣液體流出，或僅在鏡檢時方可確定有水腫；Ⅲ度(中度):一葉或數葉有斑塊狀或2個以內的小片狀出血，2葉以上的肺表面較膨滿，切面見小支氣管管腔內有少許泡沫樣液體，擠壓時有較多的液體流出；Ⅳ度(重度):一葉或數葉有3個以上的小片狀或有個別彌漫性大片狀出血，3葉以上的肺表面明顯膨脹、發亮,切面見小支氣管管腔內有較多的泡沫樣液體,不加擠壓亦可流出泡沫樣液體,個別肺葉可有淺層裂口；Ⅴ度(極重度):兩側肺臟有4葉以上的肺葉有彌漫性大片狀出血，氣管腔內積存泡沫樣液體,兩側肺表面顯著膨滿、發亮，打開胸腔后肺不萎陷，切面可見小支氣管管腔內有大量的泡沫樣液體,并有大量液體自切面自發流出，肺表面有多發性淺層裂口或深度撕裂。本實驗發現，實驗組有3只兔為重度肺損傷，其余12只為中度肺損傷，大體標本見肺明顯出血腫脹，光鏡下見肺泡壁斷裂，肺大泡形成，肺泡腔內出血。原發性肺損傷機制是：(1)沖擊波對機體胸廓直接打擊引起;(2)沖擊波的負壓引起的肺泡過速和過度擴張所致;(3)沖擊波超壓通過內爆效應引起[11]。實驗組傷后0h PaO2升高，隨著時間延長逐漸下降，傷后24h已明顯低于正常；兩肺腫脹，切面有泡沫樣液體，肺濕干比較對照組有顯著差異；病理檢查顯示肺組織內大量中性粒細胞浸潤，肺泡腔彌漫性出血、水腫，肺間質水腫明顯，肺泡間隔增寬，以上均提示可能存在的繼發因素加重了胸部爆炸傷后的肺原發損傷。IL-8、TNF-α是炎癥反應中重要的細胞因子,與炎癥反應程度密切相關。IL-8可顯著趨化中性粒細胞，誘導其脫顆粒反應、呼吸爆發和溶酶體酶釋放,從而導致過度的炎癥反應，是中性粒細胞介導的肺損傷的重要決定因素[12]。TNF-α是具有廣泛生物活性的細胞活化因子,大量研究證明,在ALI的發生發展過程中,TNF-α等炎性介質的合成、釋放，中性粒細胞在肺內的聚集、補體激活、氧自由基的生成導致的一系列病理改變中起著重要作用[13]。 本實驗發現血清IL-8、TNF-α在傷后均明顯升高，且隨著時間延長升高更明顯，BALF中IL-8、TNF-α也明顯升高，與對照組相比，差異有統計學意義，表明IL-8、TNF-α在傷后繼發肺損傷的發展中起重要作用。

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2016-08-01；

2017-01-16)

(本文編輯： 郭 衛)

國家自然科學基金青年項目(81600694)

作者單位： 221000 南京，解放軍第四五四醫院糖尿病足中心

共同第一作者： 孫新娟

通信作者： 王愛萍，E-mail:wap454hospital@hotmail.com

Experimentalstudyofacutelunginjuryinrabbitsbyunderwaterblast

WANGQian-jin1，YEChang-qing1，SHAOXian-an1，XUChang-jiang1，HUANGYi-jiang1，MAHong-hao2,HAOJian3，QIXiao-lin1

(1.123th Hospital of PLA,BengBu,AnHui 233015,China； 2.University of Science and Technology of China,Hefei 230026,China;3.Department of Cardiopulmonary Rehabilitation Center,128th Hangzhou Hospital,Hangzhou 310007,China)

ObjectiveTo establish a rabbit model of underwater blast-induced acute lung injury(ubALI) and to investigate the related mechanisms.MethodsThirty rabbits (weighing(2.04±0.35)kg) were randomly divided into two groups: control group (no injury) and experimental group(explode at 1.8 meters).The respiratory rate (RR) and arterial partial pressure of oxygen(PaO2) were assayed at 0,4,12,24h after injury. The expression of interleukin-8 (IL-8)，tumor necrosis factor-α(TNF-α) in the bronchial alveolar lavage fluid(BALF) and blood samples were measured by ELISA. Morphological changes of tissues were detected by hematoxylin and eosin(HE)staining，and pulmonary edema was determined by the wet-dry method.ResultsUbALI significantly increased RR at 0 and 4 h，and reduced PaO2at 24 h(P<0.05). UbALI significantly increased the levels of IL-8 and TNF-α in both BALF and blood samples(P<0.05). The water content in the lung markedly increased，and pulmonary edema and granulocyte infiltration were observed in lung tissues after ubALI.ConclusionThese results demonstrate that we have created a reliable and reproducible ubALI model in rabbits. This model will be helpful for studying the mechanisms of ubALI and developing strategies for clinical treatment.

lung injury; underwater explosion; animal model

1009-4237(2017)11-0865-04

R655；R826.5

A

10.3969/j.issn.1009-4237.2017.11.018

233015 安徽 蚌埠，解放軍第一二三醫院(王前進，葉長青，邵先安，徐長江，黃奕江，齊曉林)； 230026 合肥，中國科學技術大學(馬宏昊)； 310007 杭州，杭州一二八醫院心肺康復醫學中心(郝建)

齊曉林，E-mail:xlqjs@126.com