懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白CcilCSP1的結構及其結合寄主揮發物的預測分析*

付寧寧 劉 佳 渠 成 王 然 許奕華 羅 晨 李峰奇

(北京市農林科學院植物保護環境保護研究所 北京 100097)

懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白CcilCSP1的結構及其結合寄主揮發物的預測分析*

付寧寧 劉 佳 渠 成 王 然 許奕華 羅 晨 李峰奇

(北京市農林科學院植物保護環境保護研究所 北京 100097)

【目的】 分析懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白編碼基因CcilCSP1的序列和表達特征，重點研究CcilCSP1結合二球懸鈴木寄主植物揮發物的能力，旨在為CcilCSP1的功能研究提供理論參考，為通過化學感受蛋白反向模擬篩選懸鈴木方翅網蝽的信息素物質提供依據。【方法】 用分子克隆技術獲得懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白CcilCSP1基因ORF的全長序列，用RT-qPCR研究該基因的表達模式，并通過生物信息學方法分析其序列特征。用Swiss-model構建CcilCSP1蛋白的三維結構，并通過AutoDock 4.2開展CcilCSP1蛋白與寄主植物9種揮發物成份的分子對接，用Amber 14對其中結合最為穩定的反式-β-石竹烯與CcilCSP1蛋白的復合物開展了10 000 ps的分子動力學模擬，并進一步通過“Y”型嗅覺儀測定反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網蝽成蟲的行為學影響。【結果】 成功克隆到該蟲的化學感受蛋白基因CcilCSP1，且該基因在成蟲中顯著高表達。序列分析表明，CcilCSP1具有CSPs家族的典型特征，該基因與綠盲蝽的AlucCSP1，AlucCSP3，AlucCSP8以及苜蓿盲蝽的AlinCSP1親緣關系較近。同源建模和分子對接發現，在二球懸鈴木9種植物揮發物中反式-β-石竹烯與CcilCSP1的結合能力最強(kl=2.63 μm, Binding Energy=-7.61)，通過分析二者的結合特性，推測TYR-29、GLN-83、LEU-64、ASP-30可能是CcilCSP1蛋白結合反式-β-石竹烯所需的關鍵氨基酸位點。分子動力學模擬結果顯示，CcilCSP1蛋白能夠與反式-β-石竹烯穩定結合。進一步的行為學試驗表明，0.1 μg的反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網蝽成蟲有顯著的驅避作用。【結論】 本研究克隆到在成蟲中顯著高表達的懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白基因CcilCSP1。用分子對接和分子動力學模擬方法發現CcilCSP1能與二球懸鈴木寄主揮發物成份反式-β-石竹烯穩定結合，并通過進一步的行為學試驗進行證實。該研究可為懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白CcilCSP1的功能研究奠定基礎，也為基于計算機反向篩選獲得懸鈴木方翅網蝽信息素物質研發提供依據。

懸鈴木方翅網蝽； 化學感受蛋白； 寄主植物揮發物； 分子對接； 分子動力學模擬

懸鈴木(Platanusspp.)在我國是引進栽培種，包括一球懸鈴木(P.occidentalis)、二球懸鈴木(P.acerifolia)和三球懸鈴木(P.orientalis)3個種。我國廣泛栽培的是二球懸鈴木，其具有樹勢優美、繁殖生長快、抗逆性強、降噪和抗污染等優點，享有“行道樹之王”的美譽。懸鈴木方翅網蝽(Corythuchaciliata)屬于半翅目(Hemiptera)網蝽科(Tingidae)方翅網蝽屬(Corythucha)，原產于美國中東部地區(Halbertetal., 1983)，在20世紀60年代入侵到意大利，隨后相繼傳入歐洲、南美洲、亞洲和非洲等地(Maceljski, 1986; Pickeretal., 2015; Prado, 1990; Chungetal., 1996)，并造成了嚴重危害。2002年我國長沙首次發現懸鈴木方翅網蝽危害(Streito, 2006; 鞠瑞亭等, 2010)， 2006年該蟲在武漢普遍發生(王福蓮等, 2008)。目前懸鈴木方翅網蝽在我國入侵擴散范圍較廣，已入侵到湖南、湖北、上海、山東、河南和北京等地 (鞠瑞亭等, 2010; 王福蓮等, 2008; 虞國躍等, 2014)，在我國多地呈暴發態勢。

寄主植物在受到昆蟲危害后，會釋放出一系列的揮發性化合物，這些揮發物對植食性昆蟲行為有著重要的調控作用。它一方面可影響昆蟲的寄主選擇，另一方面也可在被昆蟲危害后大量釋放，趨避昆蟲或吸引天敵，形成寄主防御(Dickeetal., 1990; Turlingsetal., 1990)。從寄主植物揮發物中可以篩選到對昆蟲具有顯著引誘或驅避活性的揮發物，用于進一步研發昆蟲行為調節劑。昆蟲化學感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是一種小分子蛋白，成熟的蛋白約有 120個氨基酸組成，含有4個保守的半胱氨酸位點。化學感受蛋白與昆蟲的取食、交配、產卵點的選擇和自身防御等有著密切的關系(Fieldetal., 2000; Kaissling, 2001; Ozakietal., 2008; Pelosietal., 2005; Steinbrecht, 1998; 滑金鋒等, 2012)。在本研究中，筆者從懸鈴木方翅網蝽中克隆到一個化學感受蛋白基因CcilCSP1，對其開展序列分析和表達模式研究，模擬該蛋白的三維結構，將其與9種二球懸鈴木植物揮發物成分進行了分子對接和分子動力學研究，篩選與CcilCSP1具有穩定強結合作用的化合物，并通過昆蟲行為學來驗證結果的可靠性，為懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白CcilCSP1的功能研究提供基礎，為計算機反向篩選獲得懸鈴木方翅網蝽的行為調節劑提供依據。

1 材料與方法

1.1試驗材料

供試昆蟲 懸鈴木方翅網蝽采自中國農業科學院植物環境保護保護研究所院內二球懸鈴木葉片上，在北京市農林科學院建立種群，用懸鈴木葉片進行飼養，繁衍2代后用于試驗。

1.2試驗方法

1.2.1CcilCSP1基因的克隆與序列研究 懸鈴木方翅網蝽RNA的提取與cDNA的合成參考筆者實驗室前期建立的方法進行(Lietal., 2016)。CcilCSP1的克隆采用基因特異性引物，上下游引物分別為： 5′-ATGAAAGTTTTCGCGATTCTCG-3′，5′- TTAAATTTTAATTCCTCTTTTCTCAGCTT-3′。以懸鈴木方翅網蝽cDNA為模板，利用PrimeSTAR HS DNA polymerase(TakaRa)試劑盒進行PCR擴增。PCR擴增體系為50 μL： 10 μL 5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)，4 μL dNTP Mixture，0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase，10μmol·L-1上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，dd H2O 31.5 μL。PCR反應條件為98 ℃預變性1 min，隨后進行98 ℃，10 s、58 ℃，15 s、72 ℃，1 min共30個熱循環，然后進行72 ℃ 10 min的最后延伸。PCR產物由EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒(Trans Gen)進行回收，PCR 產物經膠回收后按照pEASY-Blunt Cloning Kit試劑盒說明克隆于pEASY-Blunt Cloning Vector載體上，重組載體轉化Trans-T1感受態細胞，然后涂在 LB 平板(含Ampicillin /X-gal/IPTG)上，37 ℃ 過夜培養。經藍白斑篩選后，挑取白色單克隆進行菌落PCR鑒定后，選取3個獨立的克隆送至北京三博遠志生物公司測序。

用生物信息學軟件對懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白測序結果進行分析，序列分析通過 DNAMAN完成，通過BLAST(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行同源序列查找，基因結構由ORF Finder (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進行預測。利用MEGA 6.0對懸鈴木方翅網蝽CcilCSP1與其他37個昆蟲CSP蛋白序列進行多序列比對并構建Neighbor-Joining(NJ)系統發育樹，Boot strip值設為1 000，cut-off value設為50%，其他昆蟲的CSP分別為： 綠盲蝽(Apolyguslucorum) (AlucCSP1: AGD80081.1; AlucCSP2: AEP95756.1; AlucCSP3: AEP95757.1; AlucCSP4: AEP95758.1; AlucCSP5: AGD80085.1; AlucCSP6: AGD80086.1; AlucCSP7: AGD80087.1; AlucCSP8: AGD80088.1)，苜蓿盲蝽(Adelphocorislineolatus) (AlinCSP1: ACZ58019.1; AlinCSP2: ACZ58021.1; AlinCSP3: ACZ58020.1; AlinCSP4: ACZ58022.1; AlinCSP5: ACZ58023.1; AlinCSP6: ACZ58024.1; AlinCSP7: ACZ58025.1; AlinCSP8: ACZ58026.1)，豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)(ApisCSP1: ACYPI000094; ApisCSP2: ACYPI000096; ApisCSP3: ACYPI000095; ApisCSP4: ACYPI000097; ApisCSP5: ACYPI000093; ApisCSP6: ACYPI009116; ApisCSP7: ACYPI005842; ApisCSP8: ACYPI000345; ApisCSP9: ACYPI003368; ApisCSP10: ACYPI002311; ApisCSP11: ACYPI39275; ApisCSP13: ACYPI53869)，腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae) (TputCSP1: KP776981; TputCSP2: KP776982)，肩突硬蜱(ixodesscapularis) (IscaCSP1: DQ855478)。蛋白性質分析采用ExPASy服務器(http:∥web.expasy.org/protparam/)進行分析，信號肽預測由 SignalP V4.1 程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/serbices/SignalP/)完成。

利用RT-qPCR檢測CcilCSP1在雌成蟲、雄成蟲及幼蟲中的表達量。熒光定量PCR所需特異性引物由IDT (https:∥www.idtdna.com/pages/support/international/)進行設計，CcilCSP1的正反向引物分別為： 5′-GCAAGAAGTGCACTGAGAAAC-3； 5′-TTGGCCAGTTCATCG-TAGTC-3′，內參基因選擇β-actin (KX108734)基因，其上下游引物為： 5′-GGGTATGGAATCTTGCGGTATC-3′； 5′-TGTTGG CGTACAGGTC-TTTC-3′。熒光定量PCR在ABI PRISM 7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)上進行，每20 μL的RT-qPCR反應體系含有GoTaq Probe qPCR Master Mix (2×) 10 μL, 正、反向引物(10 μmol·L-1)各2 μL，cDNA 模板2.0 μL，ddH2O 4 μL。PCR程序為： 95 ℃預變性2 min，隨后 95 ℃，15 s、60 ℃，1 min共40個熱循環，每個樣品進行3次重復。反應結束后采集CT值，采用2-△△Ct法進行數據分析(王思豹等, 2015)。樣品間的差異比較采用SPSS單因素方差分析SNK檢驗。

1.2.2 懸鈴木方翅網蝽CcilCSP1的同源建模及模型評價 通過Blast在Protein Date Back中搜索與懸鈴木方翅網蝽CcilCSP1序列一致性最佳 (同源性大于30%)的蛋白序列作為建模的模板(Quetal., 2015)，通過Swiss-model (Peitsch, 1996) (http:∥swiss-model.expasy.org/)，對去掉信號肽的CcilCSP1進行同源建模，獲得該蛋白的三維結構。用Procheck、Verify_3D、ERRAT方法(http:∥nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES_4/) (Laskowskietal., 1993)對模型的主鏈鍵長、鍵角的合理性，三維結構與一級結構的關系及不同原子間非鍵相互作用等特性進行評價。用PROSA(Wiederstein and Sippl, 2007)(http:∥prosa.services.came.sbg.ac.at/)來判斷CcilCSP1蛋白模型的質量。

1.2.3 懸鈴木方翅網蝽CcilCSP1蛋白的分子對接 選擇筆者實驗室前期鑒定到的二球懸鈴木9種植物揮發物成份，用于CcilCSP1的分子對接研究，用Chemoffice 2010模擬這9種植物揮發物的三維結構。用Autodock4.2(Morrisetal., 2009)編輯化合物及CcilCSP1的三維結構，設定網格參數為40點×40點×40點，格點間距為0.037 5 nm，格點盒子中心位于CcilCSP1蛋白活性位點中心，用Lamarckian遺傳算法(LGA)進行對接，設置遺傳算法參數maximum number of energy evaluations為2 500 000(莊緒靜等, 2013)，對接計算通過Autodock4.2進行，用PyMOL顯示對接結果。

1.2.4 懸鈴木方翅網蝽CcilCSP1與反式-β-石竹烯的分子動力學模擬 為了檢測對接結果的可靠性，筆者選用CcilCSP1與反式-β-石竹烯對接的復合物進行分子動力學(MD)模擬。用AMBER14(Caseetal., 2005)軟件中的Xleap模塊對對接復合物進行初始化處理，包括加氫、加電荷、加水等處理以生成拓撲文件和原子坐標文件，用Sander模塊進行對接復合物的優化和10 000 ps的分子動力學模擬，MD模擬的質量由主鏈原子的均方根位移(RMSD)評價(扈國棟, 等. 2009)。

1.2.5 反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網蝽成蟲的行為學研究 用“Y”型嗅覺儀來判斷0.1 μg反式-β-石竹烯對雌、雄懸鈴木方翅網蝽成蟲行為的影響。“Y”型嗅覺儀的兩臂及直管長度均為10 cm，直徑為1.5 cm，氣流為250 mL·min-1。采用初羽化的成蟲進行試驗。試驗中，每次接入1頭成蟲，觀察10 min內該蟲對反式-β-石竹烯的行為反應，并記錄結果，10頭蟲后，將“Y”型嗅覺儀左右顛倒，以消除試驗環境的影響。反式-β-石竹烯標準品購買自Sigma-Aldrich公司,使用液體石蠟將其稀釋至終濃度為0.01 μg·μL-1。用移液器每次取10 μL樣品加到濾紙塊上，以液體石蠟做對照，放在“Y”型嗅覺儀兩端，進行行為反應測試，試驗重復6次，每次10頭昆蟲。測試結果由卡方檢驗進行處理，統計分析采用IBM SPSS Statistics 22。

2 結果與分析

2.1懸鈴木方翅網蝽CcilCSP1的基因克隆和序列分析

通過分子克隆技術，克隆到懸鈴木方翅網蝽的CcilCSP1全長基因。其開放閱讀框為393 bp，編碼130個氨基酸，其基因序列已提交到GeneBank(編號： KY354042)。與其他半翅目昆蟲的化學感受蛋白氨基酸序列比對顯示，CcilCSP1具有CSPs家族的典型特征，含有4個保守的半胱氨酸位點(圖1)。通過CcilCSP1和其他37個昆蟲化學感受蛋白序列系統發育分析顯示(圖2)，CcilCSP1與綠盲蝽的AlucCSP1，AlucCSP3，AlucCSP8以及苜蓿盲蝽的AlinCSP1具有較近的親緣關系。此外，Nr注釋結果顯示，CcilCSP1與AlucCSP1同源性為55%(E-value為1E-41)、與AlucCSP3同源性為52%(E-value為3E-31)、與AlucCSP8同源性為52%(E-value為3E-29)，與AlinCSP1的同源性為55%(E-value 為2E-41)，綜合以上序列分析結果，暫將其命名為CcilCSP1。

圖1 懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白CcilCSP1與其他昆蟲CSP的序列比對Fig.1 Alignment of deduced amino acid sequence of CcilCSP1 with CSPs from other insect species“C”表示保守的半胱氨酸序列，其他昆蟲化學感受蛋白的GenBank登錄號如下。綠盲蝽(Apolygus lucorum)AlucCSP1：AGD80081.1；AlucCSP2：AGD80082.1； AlucCSP3：AGD80083.1；AlucCSP8：AGD80088.1；苜蓿盲蝽(Adelphocoris lineolatus)AlinCSP1：ACZ58019.1；AlinCSP2：ACZ58021.1；AlinCSP3：ACZ58020.1。 “C” represents conserved cysteines. The GenBank of the other chemosensory proteins is as below. Apolygus lucorum AlucCSP1: AGD80081.1; AlucCSP2: AGD80082.1; AlucCSP3: AGD80083.1; AlucCSP8: AGD80088.1; Adelphocoris lineolatus AlinCSP1: ACZ58019.1; AlinCSP2: ACZ58021.1; AlinCSP3: ACZ58020.1.

圖2 懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白CcilCSP1與其他昆蟲CSP蛋白的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of CcilCSP1 and CSPs from other insects虛線表示本研究的化學感受蛋白CcilCSP1及與其具有較近親緣關系的其他化學感受蛋白。The dottedline indicate the chemosensory protein CcilCSP1 and other ones that hovea close relationship with this study. Aluc： 綠盲蝽(Apolygus lucorum)； Alin： 苜蓿盲蝽(Adelphocoris lineolatus)； Apis： 豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)； Amel： 意大利蜜蜂(Apis mellifera)； Tupt： 腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)； Isca： 肩突硬蜱(Ixodes scapularis)。使用MEGA 6.0構建NJ系統發育樹，Bootstrip值設為1 000。The NJ phylogenetic tree was constructed using MEGA60,and the Bootstrip value was set to 1 000.

2.2懸鈴木方翅網蝽CcilCSP1基因的表達模式分析

用RT-qPCR技術對CcilCSP1基因在懸鈴木方翅網蝽雌成蟲、雄成蟲及幼蟲中的轉錄水平進行檢測，結果顯示：CcilCSP1基因在雌雄成蟲中的表達量極顯著高于在幼蟲中的表達量(雌成蟲/幼蟲Plt; 0.01，雄成蟲/幼蟲Plt; 0.01)，CcilCSP1在雄成蟲的表達量顯著高于雌成蟲(P=0.015) (圖3)。

圖3 RT-qPCR鑒定CcilCSP1的表達模式Fig.3 Relative expression levels of CcilCSP1 measured by real-time quantitative PCR

2.3CcilCSP1同源建模的模型分析

在PDB庫中對CcilCSP1序列進行同源性搜索，找到4種已知結構的昆蟲CSP蛋白，得分從高到低分別為MbraCSPA6、MbraCSP2、BmorCSP1、SgreCSP4，在這些序列中選擇得分最高的MbraCSPA6(score=79.0，同源性為45%)作為同源建模的模板進行模型構建。通過Procheck評估結果的Ramachandran圖(圖4)，可以看出模建蛋白94.7%的殘基落在最佳區域(紅色A、B、L區域)，5.3%的殘基落在其他較合適區(亮黃色a、b、l、p區域)，沒有殘基落在勉強許可區和不合理區已達到高質量建模標準(gt;90%)。此外， G-factor的各值(表1)均大于-0.5，說明模型蛋白共價鍵及鍵角構象是合理的。用Verify_3D對模建蛋白的三維結構與一級結構的關系進行評價發現， CcilCSP1蛋白所有殘基(100%)三維結構模型與一級結構的平均得分均大于0.2(表1)，表明模建蛋白的所有殘基都是合理的。 用ERRAT法對模建蛋白評價得分為95.789，表明模建蛋白不同原子間的非鍵相互作用是合理的。用PROSA評價得到的Z-score打分為-6.26，落在了較好結構蛋白的Z-score分布范圍。以上各評價參數結果表明，同源建模得到的蛋白模型是優質合理的。

圖4 CcilCSP1三維結構拉氏構象圖Fig.4 The Ramachandran plot of CcilCSP1圖中紅色A,B,L區域為蛋白殘基的最佳區域，亮黃色a,b,l,p區域為蛋白殘基的較合適區域，土黃色～a、 ～b、 ～l、～p區域為蛋白殘基的勉強許可區和不合理區。In the figure, the red A, B, and L regions are the best regions of the protein residues; The bright yellow a, b, l, p regions are the appropriate regions of the protein residues; The soil yellow ～a, ～b, ～l, ～p regions are the barely permitted and irrational area for protein residues.

G因子G?factors二面石Dihedrals共價鍵Covalent綜合Overall三維評估Verify＿3D誤差函數ERRATZ值Z?score017041026100%95789-626

2.4CcilCSP1與二球懸鈴木寄主揮發物的分子對接

用Autodock 4.2計算CcilCSP1與9種二球懸鈴木寄主植物揮發物成份的結合能量及抑制常數(表2)，CcilCSP1與這些揮發物的結合能量由低到高為： 反式-β-石竹烯、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、1,8-桉葉素、α-側柏烯、檜烯、γ-松油烯、月桂烯、順-3-己烯醇乙酸酯、順-3-己烯醇。反式-β-石竹烯與CcilCSP1有較低的抑制常數(kllt; 10)和結合能量，分別為2.63 μm和34.09 kJ·mol-1，認為該揮發物可通過分子間作用力與CcilCSP1蛋白形成穩定的結構。進一步分析發現，CcilCSP1與反式-β-石竹烯之間主要是通過范德華力和疏水作用相互作用的(圖5)，在CcilCSP1蛋白結合活性區域，與反式-β-石竹烯分子距離小于4?的殘基有： THR-63、LEU-64、ASN-67、ASP-60、TYR-29、ILE-32、LEU-86、ASP-30、GLN-83(圖6)。其中TYR-29與植物揮發物反式-β-石竹烯的范德華力最大，而GLN-83、LEU-64、ASP-30在反式-β-石竹烯周圍形成氫鍵結構將其包裹在其中。TYR-29、GLN-83、LEU-64、ASP-30可能是反式-β-石竹烯與CcilCSP1結合的關鍵位點。

表2 9種寄主植物揮發物與CcilCSP1分子對接結果Tab.2 Binding affinities of nine host-plantvolatiles to CcilCSP1

圖5 反式-β-石竹烯與CcilCSP1蛋白活性結構域的結合Fig.5 Trans-β-caryophyllene docked into the active-site of CcilCSP1 protein

圖6 反式-β-石竹烯與CcilCSP1蛋白結合關鍵氨基酸位點及相互作用Fig.6 Diagram of the key amino acid sites and interaction of trans-β-caryophyllene with CcilCSP1 protein

2.5CcilCSP1與反式-β-石竹烯復合物的分子動力學研究

為了驗證分子對接結果，進一步通過10 000 ps分子動力學研究，計算了CcilCSP1與反式-β-石竹烯復合物的主鏈原子RMSD值，RMSD值是指在分子動力學模擬過程中，復合物體系主鏈碳原子的均方根偏差，其變化是用來衡量復合物體系是否穩定的重要依據之一。從懸鈴木方翅網蝽CcilCSP1蛋白與反式-β-石竹烯復合物的RMSD值變化曲線(圖7)可以看出，前50 ps為升溫過程，體系從0 K加熱到300 K，RMSD變化很大。接下來50 ps是動力學平衡過程，復合物內部結構進行優化，RMSD值上升至2.5?。最后10 000 ps是穩定過程，復合物的RMSD值基本趨于平衡，RMSD值為3.0?，振幅僅為0.3?，證明懸鈴木方翅網蝽CcilCSP1蛋白與反式-β-石竹烯能夠穩定結合。

圖7 MD過程中復合物主鏈碳原子均方根偏差(RMSD)Fig.7 Root-Mean-Square Deviation(RMSD) of backbone atoms in MD simulation

2.6反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網蝽成蟲的行為學影響

結合分子對接和分子動力學的結果表明，反式-β-石竹烯能與CcilCSP1活性部位結合，形成穩定的結構。結合RT-qPCR結果，推測反式-β-石竹烯可能影響懸鈴木方翅網蝽成蟲的行為反應。為證實上述研究結果，進一步用“Y”型嗅覺儀檢測了反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網蝽成蟲的行為影響，經卡方檢驗發現(圖9)，反式-β-石竹烯對雌成蟲和雄成蟲均有顯著的驅避作用(雌成蟲：χ2=6.4，Plt; 0.05； 雄成蟲：χ2=5.488，Plt; 0.05)。

圖8 反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網蝽成蟲行為的影響Fig.8 Responses of C. ciliata to trans-β-caryophyllene

3 討論

筆者報道了懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白編碼基因CcilCSP1，序列分析表明，CcilCSP1與綠盲蝽的AlucCSP1、AlucCSP3、AlucCSP8以及苜蓿盲蝽的AlinCSP1具有較近的親緣關系，推測它們具有相似的功能。前人的研究發現，AlinCSP1和AlucCSP1對寄主植物揮發物具有較高的結合能力(滑金鋒等, 2012)。其中，苜蓿盲蝽AlinCSP1能夠結合植物活性物質(Z)-3-hexen-1-ol, (E)-2-hexen-1-al和valeraldehyde (Guetal., 2012)。在本研究中通過分子對接和動力學研究，表明CcilCSP1其能夠結合二球懸鈴木寄主植物揮發物成分，該結果與其同源基因在苜蓿盲蝽和綠盲蝽中的報道相一致(Guetal., 2012； 滑金鋒等, 2012)。CcilCSP1的表達模式研究表明，CcilCSP1在雌雄成蟲中顯著高表達，這與后續的行為學結果相一致。此外，CcilCSP1基因在雄蟲中的表達量顯著高于雌蟲中的表達量，這可能是因為CcilCSP1的功能具有多樣性，可能參與了對懸鈴木方翅網蝽性信息素物質的結合，由于懸鈴木方翅網蝽的性信息素成份尚未報道，在未來對CcilCSP1的功能尚需進一步的深入研究。

通過分子對接和分子動力學分析發現，CcilCSP1與寄主揮發物反式-β-石竹烯的結合能力最強。反式-β-石竹烯是一種常見的植物揮發物，能夠影響多種昆蟲的行為。通過“Y”型嗅覺儀研究發現，反式-β-石竹烯對懸鈴木方翅網蝽成蟲具有顯著地驅避效果，前期研究發現反式-β-石竹烯對煙粉虱(趙艷群等， 2012)和草地夜蛾(Spodopterafrugiperda) (Smithetal., 2012)等均有顯著驅避作用，與本研究結果相類似。此外，本研究發現TYR-29、GLN-83、LEU-64、ASP-30可能是反式-β-石竹烯與CcilCSP1蛋白結合的關鍵位點，該結果還需要進一步通過定點突變技術和嗅覺蛋白熒光結合試驗來驗證。

4 結論

本研究克隆到懸鈴木方翅網蝽的化學感受蛋白基因CcilCSP1，該基因具有化學感受蛋白的典型特征并在成蟲中顯著高表達。通過分子對接和分子動力學方研究，發現CcilCSP1能與二球懸鈴木寄主植物成份反式-β-石竹烯穩定結合，行為學試驗發現反式-β-石竹烯能顯著驅避懸鈴木方翅網蝽成蟲。該研究為今后的懸鈴木方翅網蝽化學感受蛋白CcilCSP1的功能研究奠定了基礎，也為通過計算機發現篩選懸鈴木方翅網蝽信息素物質提供了依據。

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(責任編輯 朱乾坤)

AnalysisofCorythuchaciliataCcilCSP1StructureandPredictionofItsBindingtoHost-PlantVolatiles

Fu Ningning Liu Jia Qu Cheng Wang Ran Xu Yihua Luo Chen Li Fengqi

(InstituteofPlantandEnvironmentProtection,BeijingAcademyAgricultureandForestrySciencesBeijing100097)

【Objective】Corythuchaciliata(Say) is an important invasive forest pest, and seriously damagesPlatanusspp. This paper analyzes the sequence and expression characteristics of chemosensory proteins 1 (CcilCSP1), focus on the ability of CcilCSP1 binding to host volatiles ofP.acerifolia. This study gims to provide a foundation for studying function of the chemosensory protein and a useful reference for searching the pheromone substance.【Method】 The full-length ORF sequence of CcilCSP1 was obtained by the molecular cloning technique. The expression pattern of CciCSP1 was analyzed by RT-qPCR. The three-dimensional structure of chemosensory protein CcilCSP1 was mimicked, and nine plant volatiles were docked to the CcilCSP1 by AutoDock 4.2. The molecular dynamics simulation analysis was carried out to the docking complex oftrans-β-caryophyllene and CcilCSP1. The effects oftrans-β-caryophyllene on theC.ciliatawere assayed by Y-tube olfactometer.【Result】 The CcilCSP1 gene ofC.ciliatawas cloned and sequenced, and it was highly expressed in adults. The sequence analyses showed that CcilCSP1 had the typical characteristics of CSPs, and closely related with AlucCSP1, AlucCSP3, AlucCSP8 and AlinCSP1. The binding capacity oftrans-β-caryophyllene to CcilCSP1 was strongest (kl=2.63 μm, Binding Energy=-7.61) in nine volatiles. It is suggested that TYR-29, GLN-83, LEU-64 and ASP-30 may be ligand-binding active sites. Molecular dynamics simulations showed that CcilCSP1 protein could bind totrans-β-caryophyllene stably. Furthermore, behavioral experiments showed that 0.1 μgtrans-β-caryophyllene had a significant evading effect on the adults ofC.ciliata.【Conclusion】CcilCSP1, a chemosensory protein gene highly expressed inC.ciliataadults, was cloned and sequenced in this study. Molecular docking and molecular dynamics simulations were used to investigate the interaction between CcilCSP1 andtrans-β-caryophyllene, which was confirmed by the behavioral experiment. This study lays a foundation for the functional study of the protein CcilCSP1 ofC.ciliata, and provid a useful reference for searching for the pheromone substance.

Corythuchaciliata； chemosensory proteins(CSPs)； homology modeling； host-plant volatiles； molecular docking； dynamics simulation

10.11707/j.1001-7488.20171012

2016-10-12；

2017-02-05。

北京市科技計劃課題(Z151100001115002); 北京市農林科學院科技創新能力建設專項(KJCX20170709)。

*李峰奇為通訊作者。

S718.7

A

1001-7488(2017)10-0109-09