基于SSR的刺槐無性系遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建*

毛秀紅 鄭勇奇 孫百友 張元帥 韓叢聰 位 曉 荀守華

(1. 中國林業科學研究院林業研究所 林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林業局森林培育重點實驗室 北京 100091； 2. 山東省林業科學研究院 山東省林木遺傳改良重點實驗室 濟南 250014； 3. 山東費縣大青山林場 費縣 273402； 4. 勝利油田勝大集團 東營 257083)

基于SSR的刺槐無性系遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建*

毛秀紅1,2鄭勇奇1孫百友3張元帥3韓叢聰2位 曉4荀守華2

(1. 中國林業科學研究院林業研究所 林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林業局森林培育重點實驗室 北京 100091； 2. 山東省林業科學研究院 山東省林木遺傳改良重點實驗室 濟南 250014； 3. 山東費縣大青山林場 費縣 273402； 4. 勝利油田勝大集團 東營 257083)

【目的】 對山東省刺槐無性系進行遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建，為刺槐新品種選育、遺傳改良和品種鑒定提供可靠的依據，為中國其他省市刺槐遺傳資源保存、評價與利用提供參考。【方法】 采用熒光SSR引物進行PCR擴增，產物經毛細管電泳儀進行檢測； 利用所得結果分析49個無性系遺傳多樣性并構建其指紋圖譜； 采用非加權組平均法(UPGMA)進行基于親緣關系的無性系聚類分析。【結果】 8對SSR引物共檢測到51個等位基因，每個位點的等位基因為2～15個，平均每對引物擴增出6.375個多態性等位基因。不同位點的PIC值變化范圍很大，在0.092～0.879之間，平均PIC值為0.509 8。使用組間平均數聯結法進行UPGMA聚類分析，結果表明49份無性系沒有嚴格按照不同區域聚類到一起，無性系分組與現有栽培區沒有明顯的規律。來自臨沂的‘魯刺8’和‘魯刺13’、青島的‘魯刺40’和‘魯刺42’以及日照的‘魯刺10’和‘魯刺86’親緣關系最近。本研究所使用的9對引物中，其中2對Rply109和rops16可以區分開45份無性系，鑒定率達到91.84%。檢測到22個刺槐無性系在1個或者2個位點得到3個等位基因，表明這些無性系可能是發生自然變異的多倍體。【結論】 山東省刺槐具有較高的遺傳多樣性。無性系分組與現有栽培區沒有明顯的規律。引物Rply109和rops16對49份無性系的分子鑒定率為91.84%，可作為刺槐指紋圖譜構建和分子鑒定的高效分子標記。利用SSR標記構建的指紋圖譜可為刺槐遺傳資源管理、品種鑒定和知識產權保護奠定堅實的基礎，同時為刺槐的引種和遺傳育種親本選擇提供科學的理論依據。

刺槐； SSR； 分子標記； 遺傳多樣性； 指紋圖譜； 聚類分析

刺槐(Robiniapseudoacacia)為豆科(Leguminosae)刺槐屬(Robinia)闊葉大喬木(2n=22)，原產美國，速生、抗旱、耐瘠薄、耐輕度鹽堿，適宜多種土壤和氣候條件，具有很高的觀賞、材用、生態防護、蜜源和飼用價值。1601年被引入法國，至18世紀遍布歐洲各國(Keresztesi, 1980)； 1897年由德國人引入中國青島(陳一山等， 2005)，這是據文獻記載最早引入中國的刺槐遺傳資源。此后的100年里，又有來自美國、朝鮮等刺槐遺傳資源引入山東省(顧萬春等， 1991)，部分優樹無性系現在收集保存在山東省費縣大青山林場刺槐種質資源庫。山東在中國引種刺槐歷史最早，栽培也很廣泛，但是各地栽培的刺槐來源記載不清，遺傳關系不明，遺傳多樣性狀況信息甚少，急需開展刺槐遺傳多樣性評價，為刺槐新品種選育或者遺傳改良奠定基礎。

植物遺傳多樣性的研究方法主要有形態學標記、細胞學標記、生理生化標記以及分子標記4大類，它們分別從宏觀和微觀角度，以及個體、細胞和分子3個水平為植物的遺傳多樣性研究提供有價值的信息。前人在刺槐形態性狀(Keresztesi， 1980； 李善文等， 1997)、蛋白(Surlesetal.， 1989； Majoretal.， 1998； 楊敏生等， 2004)和分子(Majoretal.， 1998； Bindiyaetal.， 2003； 韓宏偉， 2007； 孫芳等， 2009； 王東升等， 2012)3個不同水平上分別做了相關研究，發現刺槐變異類型很多，遺傳多樣性豐富。相對于顯性標記，SSR是共顯性標記，具有多態性高、穩定性高、分布廣泛等優點，被視為是檢測植物遺傳多樣性和遺傳分化的最有效標記(Ellegren， 2004)，在國內被廣泛應用于植物遺傳多樣性評價或品種鑒定(馮錦霞等， 2011； 李美芹等， 2016； Sunetal.， 2016)。SSR分子標記也已經被應用于紅花刺槐(R.pseudoacaciavar.decaisneana)和香花槐(R.pseudoacacia‘Idaho’)的品種鑒定(方志達， 2006)、航天誘變刺槐群體遺傳多樣性分析(袁存權等， 2010)。趙克奇等(2014)進行了刺槐EST-SSR標記PCR反應體系的優化，為以后應用于刺槐遺傳多樣性評價奠定了很好的基礎。因此，應用SSR分子標記分析山東省刺槐無性系遺傳多樣性和構建指紋圖譜，有助于了解我國刺槐多樣性分布，鑒別無性系和制定雜交育種策略等。

本研究采用SSR分子標記對來自膠東半島(青島、威海、煙臺)、魯南(臨沂、日照)、魯中(濟南、泰安、萊蕪、淄博、濰坊)、魯西南(濟寧、菏澤、棗莊)和魯西北(德州、濱州、聊城、東營)5個不同刺槐栽培區的49份刺槐無性系進行遺傳多樣性評價和指紋圖譜構建，以期為刺槐新品種選育、遺傳改良和品種鑒定提供可靠的依據，為中國其他省市刺槐遺傳資源保存、評價與利用提供參考。

1 材料和方法

1.1試驗材料和采樣地點

試驗材料為1973—2014年山東省不同地市從刺槐實生群體中篩選出的49株優樹(表1)，通過嫁接保存到山東省禹城市刺槐屬植物種質資源庫和山東省費縣大青山林場刺槐種子園。從以上2個地點采集幼嫩葉片，硅膠干燥，備用。

1.2DNA提取與熒光引物PCR擴增

所有無性系的葉片DNA均采用英芮誠生化科技(上海)有限公司植物組織基因組DNA提取試劑盒(磁珠法)(貨號PTED-6030)按照說明書進行提取，并采用多功能酶標儀(Spectra Max i3，上海)檢測所提DNA濃度和OD260/OD280值，檢測結果在1.6～1.9之間的-20 ℃保存備用。

表1 刺槐樣品信息①Tab.1 Sampling information of Robinia pseudoacacia

①GB1: 山東省禹城市刺槐屬植物種質資源基因庫； GB2: 山東省費縣大青山林場。GB1: Germplasm gene bank ofR.pseudoacaciain Yucheng city, Shandong province; GB2: Daqingshan Forest Farm in Feixian, Shandong province.

根據文獻收集到的刺槐SSR引物，選取9對用于本研究(趙克奇等， 2014； Lianetal.， 2004)。引物由北京市睿博興科生物技術有限公司合成，純化方式PAGE。引物的編號、重復單元、引物序列、片段長度、退火溫度以及所用熒光見表2。

熒光引物PCR擴增體系： 2×Taq PCR MasterMix由北京市睿博興科生物技術有限公司生產。PCR選用10 μL體系： DNA(20 ng·μL-1)0.5 μL，滅菌去離子水4.3 μL，2×Taq PCR MasterMix 5 μL，正反引物各0.1 μL。

熒光引物PCR擴增程序采用Touchdown模式： 95 ℃預變性5 min； 95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s(每個循環降低0.5 ℃)，72 ℃延伸40 s，14個循環； 95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s， 20個循環； 72 ℃延伸10 min。

表2 本研究所用9對SSR引物信息Tab.2 9 pairs of SSR primers used in this study

1.3毛細管電泳上機檢測

用毛細管電泳儀ABI 3730XL檢測PCR產物等位基因數目。取PCR產物各0.3 μL、分子量內標(生產商ABI)0.5 μL和去離子甲酰胺(生產商ABI)9.5 μL混合加入PCR板，95 ℃變性5 min，4 ℃冷卻后離心，1×Buffer緩沖液上機檢測。基因分析儀生產廠家是ABI公司，型號3730xl DNA analyzer，所用參數如下： 工作電壓15.0 kV，進樣電壓1.6 kV，噴射持續時間15 s，穩壓電流30.0 μA。

1.4數據分析

采用Genemarker 2.2.0軟件進行數據整理分析； 用GenALEx軟件(Peakalletal., 2012)計算平均等位基因數Na、有效等位基因數Ne和Shannon信息指數I； 用CERVUS version 3.0(Kalinowskietal.， 2007)計算多態性信息量PIC。

使用組間平均數聯結法進行聚類分析，得到山東省49份無性系的UPGMA親緣關系圖。

1.5指紋圖譜構建與無性系鑒定

根據每對SSR引物的帶型結果，組合形成每個無性系的SSR指紋圖譜，根據指紋圖譜的差異，再區分無性系。

2 結果與分析

2.1刺槐遺傳多樣性分析

9個SSR位點中有1個在個別樣品中得不到PCR擴增產物(GenAlEx軟件不識別)，故采用8個位點進行計算。在49個樣本中共擴增出51個等位基因，每個位點的等位基因數為2～15個，平均每個位點擴增出6.375個等位基因，最多的rops16有15個等位基因，Rply109次之，有10個等位基因，最少的是Rply31，只有2個等位基因(圖1)。不同位點的PIC值變化范圍很大，在0.092～0.879之間，平均PIC值為0.509 8(表3)。根據Botstein(1980)的理論，有1個標記為低度多態位點(PIClt;0.25)，3個標記為中度多態位點(0.25lt;PIClt;0.5)，其他4個為高度多態位點(PICgt;0.5)。以上遺傳多樣性參數表明山東省49份刺槐無性系具有較高的遺傳多樣性。

圖1 部分刺槐無性系在Rply31位點的等位基因變異Fig.1 Allelic phenotype of Robinia pseudoacacia clones at Rply31 locus

引物Locus樣本量N等位基因數Na有效等位基因數NeShannon信息指數I多態信息指數PICRply1094910000483117800767Rply22494000150306770314Rply16498000180410410430Rply01494000241210060505Rply02495000333213170649rops164915000932424250879Rply31492000110702020092Rply32493000219608570442均值Mean4963753314116305098

①N: Number of samples;Na: Number of alleles;Ne: Effective number of alleles;I: Shannon’s information index; PIC: Polymorphic information content.

2.2不同來源地刺槐無性系之間遺傳關系

使用組間平均數聯結法對山東省49份刺槐無性系進行聚類分析，得到的親緣關系如圖2所示。來自臨沂的4號(‘魯刺8’)和8號(‘魯刺13’)、來自青島的14號(‘魯刺40’)和15號(‘魯刺42’)以及來自日照的6號(‘魯刺10’)和40號(‘魯刺86’)親緣關系最近，最先聚在一起，說明它們遺傳基礎相近，可能來自同一種源。全部無性系聚為2大類： 第Ⅰ類共有5份，包含了沿海地區青島1份(36號)、日照3份(6、40和27號)和濰坊1份(47號)； 第Ⅱ類共有44份，占89.80%，包含的無性系非常豐富，涵蓋的區域廣。第Ⅱ類又可以分為3個亞類： Ⅱ-a共有6份，分別是魯西南2份(19號和21號)、魯南2份(32號和28號)和魯中2份(31號和22號)； Ⅱ-b共有33份，包含膠東半島13份(煙臺的3號、威海的38號和青島的1、37、13、34、45、44、12、2、35、15、14號)、魯西北3份(東營的24和23號以及德州的46號)、魯南9份(日照的25號和臨沂的4、8、18、49、5、7、33、39號)、魯西南4份(菏澤的29號、濟寧的41號和棗莊的16、43號)和魯中4份(10、11、20和48號)； Ⅱ-c共有5份，包含魯南2份(26號和9號)、魯西南2份(17號和42號)和青島1份(30號)。由上可以看出這49份無性系聚類結果與地理區域并不完全相符，無性系分組與現有栽培區沒有明顯的規律，說明來自相同地區的刺槐無性系之間遺傳差異較大。這與王東升等(2012)使用AFLP標記分析得出的結論“山東省刺槐無性系的聚類與地理位置不完全相關”一致。

圖2 基于SSR數據的49份刺槐無性系UPGMA聚類分析Fig.2 Dendrogram of 49 accessions Robinia pseudoacacia germplasms based on SSR data using UPGMA method樣品編號詳細信息見表1。See Tab.1 for sample number details.

2.3指紋圖譜構建與品種鑒定

利用毛細管電泳檢測熒光PCR產物，共獲得49個無性系9個SSR位點的DNA指紋圖譜(表4)。所有無性系都不具有特征譜帶，無法僅用1對引物將某個無性系與其他無性系區分開，因此需要利用引物組合進行區分。所使用的9對引物中，其中2對Rply109和rops16除了區分不開‘魯刺62’和‘魯刺90’、‘魯刺57’和‘魯刺103’這4份無性系外，可以區分開其他45份無性系，鑒定率達到91.84%，而其他7對引物，也不能將以上4份無性系區分開，因此后續研究需要開發更有效的SSR引物或采用更多的引物對。

另外，本研究使用9對SSR引物對49份無性系進行分析時發現‘魯刺2’、‘魯刺10’、‘魯刺14’、‘魯刺28’、‘魯刺36’、‘魯刺38’、‘魯刺40’、‘魯刺47’、‘魯刺57’、‘魯刺61’、‘魯刺62’、‘魯刺68’、‘魯刺84’、‘魯刺87’、‘魯刺90’、‘魯刺102’、‘魯刺103’、‘魯刺155’、‘膠29’、‘魯刺229’、‘壯美青山’和‘青山紐姿’共22份無性系在1個位點有3個等位基因，尤其是其中的‘魯刺28’(圖3)、‘魯刺40’和‘魯刺87’這3份無性系在2個位點均得到3個等位基因(表4)，表明這22份無性系可能是自然變異的多倍體。

表4 49份刺槐無性系的指紋圖譜①Tab.4 Fingerprint map of 49 clones of Robinia pseudoacacia bp

①無性系編號同表1； *表示缺失值。Codes of clones see Tab.1； *means the missing value.

圖3 ‘魯刺28’在rops16和Rply43位點的等位基因變異Fig.3 Allelic phenotype of Robinia pseudoacacia ‘Luci 28’ at rops16 and Rply31 locus

3 討論

每個位點上等位基因的數目是最直接度量遺傳多樣性豐富度的參數之一(徐剛標， 2009)。袁存權等(2010)利用篩選到的8對多態性好、條帶清晰的SSR引物對刺槐航天誘變和地面對照共計48個植株組成的群體進行SSR分析，平均每個位點擴增出3.125個等位基因。本研究也是利用8對SSR引物對49個刺槐樣本分析得到了每個位點上等位基因的數目2～15個，平均數目是6.375個，是袁存權等(2010)所得的等位基因數目2.04倍。分析原因可能有2個： 一是所用的引物不完全一樣，引物的多態性不一樣； 二是所用刺槐材料不同，袁存權等(2010)所用材料是來自河南林場的2 000粒刺槐種子，其中1 000粒進行航天誘變，另1 000粒作對照，播種育苗后共取48個植株進行SSR檢測，各材料親緣關系較近。另外洪丕征(2011)利用9對AFLP引物得到所有位點的等位基因數目平均為1.551 4。本研究得到的等位基因數目明顯高于洪丕征(2011)的研究結果，主要是由所用的分子標記不同和所分析的刺槐材料不同導致的。

據Keresztesi(1980)記載，刺槐在美國的天然分布區分為2部分： 東部分布區從賓夕法尼亞州中部延伸到亞拉巴馬和佐治亞州北部的阿帕拉契安山脈，其中包括西弗吉尼亞州的一部分、弗吉尼亞、馬里蘭德、肯塔基、田納西和南、北卡羅來納州，在佐治亞州中部的南俄亥俄和印第安納西南部也有刺槐分布； 西部分布區包括密蘇里南部的奧扎克高原，阿爾堪薩斯與東奧克拉荷馬的北部和東部，在伊利諾斯南部和印第安納西南部也有零星分布。本研究發現49份無性系聚為2大類(圖2)，推測這2大類無性系有可能分別來自2個不同的區域，即美國的東部分布區和西部分布區。

在構建指紋圖譜時發現使用9對引物區分不開‘魯刺62’和‘魯刺90’、‘魯刺57’和‘魯刺103’這4份無性系，后來作者所在實驗室又利用新開發的9對引物依然區分不開這4份無性系，推測它們可能是同物異名。查看親緣關系圖(圖2)發現，這4份無性系均在第2大類中的a類出現，且‘魯刺62’(21號)和‘魯刺90’(28號)、‘魯刺57’(19號)和‘魯刺103’(31號)親緣關系最近，分別最先聚在一起。查閱這4份無性系檔案材料，發現‘魯刺62’來自棗莊滕縣，‘魯刺90’來自臨沂費縣； ‘魯刺57’來自菏澤曹縣，‘魯刺103’來自淄博沂源縣，是山東省不同地市在引種過程中從種子實生苗中選育出的速生抗逆優株。這一證據排除了不同地市間互相引種造成的“同物異名”。具體是否是同物異名，后期應該加大引物使用對數，進一步做SSR檢測，并結合表型性狀才能下定論。但是不論它們是否是同物異名，鑒于親緣關系太近，在選擇雜交親本時最好避免同時用作父母本。

韓國輝(2012)在利用EST-SSR對柑橘(Citrusreticulata)多倍體進行遺傳分析后，認為SSR分子標記可以作為不同倍性植株染色體倍性確認的一個參考； 賈會霞等(2015)在對24份楊樹無性系進行SSR指紋圖譜構建時發現，5份無性系均擴增出3個不同等位基因，其余19份只出現1個或2個等位基因，FCM檢測結果證實這5份無性系均為三倍體，因此認為SSR標記能夠準確地反映植物的倍性。本研究檢測到‘魯刺2’、‘魯刺10’等22份無性系在1個位點或者2個位點有3個等位基因，說明這些無性系可能是多倍體。北京林業大學1997年從韓國引入我國的飼料型四倍體刺槐K1-K5，是由人工誘導二倍體刺槐體細胞加倍而育成。目前國內外尚沒有其他發現或者培育四倍體刺槐的報道。本實驗室前期對這5個四倍體刺槐無性系K1-K5也做了上述9對引物的SSR分析，發現4個無性系K1-K4只在rops16位點出現3個等位基因，K5除在Rply43位點出現缺失外，其余8個位點各出現1個或者2個等位基因。后來本實驗室又利用新開發的9對EST-SSR引物進一步驗證，發現K5在RP7和RP13兩個位點分別有3個和4個等位基因。本研究從分子水平驗證了K1-K5是多倍體。同時韓國人對K1-K5做的核型分析結果從染色體水平驗證了這5個無性系確實是多倍體(Kim， 1973)。

本研究檢測到49份無性系中‘魯刺2’、‘魯刺10’等共22份可能是發生自然變異的多倍體。隨后經過查閱大青山林場提供的林木種質資源共性描述表，發現除了‘青山紐姿’外，其余21份無性系均具有典型的多倍體植株形態學特點，如高產(速生)、優質和抗逆。具體確認這22個無性系是幾倍體，需要進一步做核型分析，觀察染色體組成，才能下定論。

4 結論

山東省刺槐具有較高的遺傳多樣性，無性系分組與現有栽培區沒有明顯的規律； 引物Rply109和rops16對49份無性系的分子鑒定率為91.84%，可作為指紋圖譜構建、分子鑒定的高效分子標記； 利用SSR標記構建的指紋圖譜可為刺槐遺傳資源管理、品種鑒定和知識產權保護奠定堅實的基礎，為刺槐的引種和遺傳育種選擇親本提供科學的理論依據。

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(責任編輯 徐 紅)

GeneticDiversityandFingerprintsofRobiniapseudoacaciaClonesBasedonSSRMarkers

Mao Xiuhong1, 2Zheng Yongqi1Sun Baiyou3Zhang Yuanshuai3Han Congcong2Wei Xiao4Xun Shouhua2

(1.StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreedingKeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivationoftheStateForestryAdministrationResearchInstituteofForestry，ChineseAcademyofForestryBeijing100091; 2.ShandongProvincialKeyLaboratoryofForestTreeGeneticImprovementShandongAcademyofForestryJinan250014; 3.DaqingshanForestFarm,Feixian,ShandongFeixian273402; 4.ShengliOilfieldShengdaGroup,ShandongDongying257083)

【Objective】To analyze genetic diversity and to construct the fingerprints ofRobiniapseudoacaciaclones selected in Shandong province, which can lay a solid foundation forR.pseudoacacianew varieties selection, breeding and identification, and also provide a scientific basis for the conservation, assessment and utilization ofR.pseudoacaciain other provinces of China.【Method】Fluorescent SSR primers were used for PCR amplification. The products were detected with capillary electrophoresis. The results were used to analyze genetic diversity and to construct fingerprints of 49R.pseudoacaciaclones. 【Result】A total of 51 alleles were identified using 8 pairs of SSR primers, with a mean of 6.375 alleles per locus, ranging from 2-15. The mean value of PIC was 0.509 8, ranging from 0.092-0.879. Clustering analysis conducted with the method of average linkage between groups showed that clones ‘Luci 8’ and ‘Luci 13’ from Linyi, ‘Luci 40’ and ‘Luci 42’ from Qingdao, ‘Luci 10’ and ‘Luci 86’ from Rizhao displayed the closest genetic relationship, respectively. The 49 clones were not clustered together strictly in accordance with geographic areas. There were no obvious correlations between grouping and current growing regions of the clones. A total of 9 primer pairs were used for clonal identification, two of them namely Rply109 and rops16 can distinguish 45 clones, indicating an identification rate of 91.84%. Three alleles at one or two loci were detected in 22 clones, suggesting that these clones may be natural polyploidies.【Conclusion】R.pseudoacaciain Shandong province has relatively high genetic diversity. There were not obvious correlations between grouping and current growing regions of the clones. The two primers Rply109 and rops16 were determined to be efficient SSR markers for fingerprints construction and molecular identification ofR.pseudoacaciaclones, which can distinguish a proportion of 91.84% of the total number of clones. The fingerprints constructed with SSR markers can provide a basis for germplasm resources management, variety identification and intellectual property rights protection, it also provides a scientific basis for introduction, genetic improvement and breeding ofR.pseudoacacia.

Robiniapseudoacacia； SSR； molecular marker； genetic diversity； fingerprint； cluster analysis

10.11707/j.1001-7488.20171009

2017-03-14；

2017-07-20。

國家林業公益性行業專項“刺槐屬種質資源收集保存與創新利用研究”(201304116)。

*荀守華為通訊作者。

S718.46； S718.49

A

1001-7488(2017)10-0080-10