大興安嶺篤斯越橘內(nèi)生真菌及礦質(zhì)養(yǎng)分特性分析*

白永超 陳 露 衛(wèi)旭芳 蔣潤(rùn)迪 李彬彬 宮中志 侯智霞

(北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 藍(lán)莓研究發(fā)展中心 北京 100083)

大興安嶺篤斯越橘內(nèi)生真菌及礦質(zhì)養(yǎng)分特性分析*

白永超 陳 露 衛(wèi)旭芳 蔣潤(rùn)迪 李彬彬 宮中志 侯智霞

(北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 藍(lán)莓研究發(fā)展中心 北京 100083)

【目的】 分析篤斯越橘根系內(nèi)生真菌的多樣性、侵染率、侵染結(jié)構(gòu)及宿主礦質(zhì)元素含量，明確內(nèi)生真菌侵染對(duì)篤斯越橘礦質(zhì)元素的影響。【方法】 以大興安嶺山地、水濕地凍土、水濕地有土壤3種立地類型的篤斯越橘為研究對(duì)象，應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)高通量測(cè)序技術(shù)(ITS)分析篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性，使用多元統(tǒng)計(jì)分析法，研究?jī)?nèi)生真菌侵染率與宿主礦質(zhì)元素間的相互關(guān)系。【結(jié)果】 1) 大興安嶺地區(qū)篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性(H′=3.58～4.36)及侵染結(jié)構(gòu)(根外菌絲、胞間有隔菌絲、胞間無隔菌絲、胞內(nèi)菌絲團(tuán)、表皮細(xì)胞缺失)較豐富，侵染率較高(54.98%～68.09%)； 篤斯越橘根系內(nèi)生真菌具有立地類型特異性，其中水濕地有土壤類型和山地類型以Phialocephala為優(yōu)勢(shì)菌屬，而水濕地凍土類型的優(yōu)勢(shì)菌屬為Meliniomyces。2) 3種立地類型中，篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性、侵染率均以水濕地凍土類型最高，山地類型次之，水濕地有土壤類型最低，篤斯越橘N、K、Ca、Fe元素的豐度與根系內(nèi)生真菌多樣性及侵染率呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。3) 根系內(nèi)生真菌侵染率與宿主植物N、P、K、Ca、Fe元素呈顯著或極顯著正相關(guān)，而與Zn元素呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.944**)。【結(jié)論】 內(nèi)生真菌對(duì)篤斯越橘礦質(zhì)養(yǎng)分的積累有顯著的促進(jìn)或抑制作用，推測(cè)內(nèi)生真菌侵染是影響篤斯越橘礦質(zhì)元素含量的重要因子，環(huán)境條件是影響篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性和豐度的重要因素。

篤斯越橘； 內(nèi)生真菌； 多樣性； 侵染狀況； 礦質(zhì)養(yǎng)分

篤斯越橘(Vacciniumuliginosum)為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)多年生落葉小灌木，集中分布于我國(guó)大、小興安嶺及長(zhǎng)白山地區(qū)，抗寒性極強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，是極具開發(fā)價(jià)值的天然寒地漿果資源(伏鴻峰， 2013)。在大興安嶺的林間空地、針葉、闊葉及混交林中有大面積的篤斯越橘分布，豐產(chǎn)期果實(shí)年產(chǎn)量每公頃可達(dá)數(shù)十萬(wàn)噸，具有“越橘之鄉(xiāng)”之美譽(yù)(劉金江， 2013)。近年來，由于氣候變暖、林火頻發(fā)以及人們對(duì)篤斯越橘高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的青睞引起的破壞性采摘等原因，使得篤斯越橘分布面積和產(chǎn)量大幅下降，種質(zhì)多樣性逐漸減少，極大的限制了我國(guó)篤斯越橘的資源保護(hù)、開發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展(王賀新等， 2012)。

杜鵑花科植物根系在自然生境中可與土壤真菌形成一種特殊類型的互惠共生體，即杜鵑花類菌根(ericoid mycorrhizal, ERM)，對(duì)宿主植物不但沒有損傷作用(Koronetal., 2000; Carrilloetal., 2015)，還可激發(fā)宿主植物對(duì)生物和非生物脅迫的防御機(jī)制(Brundrett, 2002; Scagel, 2005; Pignaetal., 2013)。為探討ERM真菌在篤斯越橘栽培及繁育中的積極作用，Powall等(1984)用錘舌菌屬(Hymenoscyphus)的H.ericae菌株接種高叢越橘(Vacciniumcorymbosum)后，宿主生長(zhǎng)量及果實(shí)產(chǎn)量明顯增加； Korno等(2000)用樹粉孢屬(Oidiodendron)的O.rhodogenum和O.griseum接種1年生越橘(Vacciniumcorymbosum)后，宿主葉面積和干質(zhì)量較對(duì)照明顯增加。上述研究為了解ERM真菌對(duì)篤斯越橘的回接效應(yīng)提供了參考，但對(duì)于特殊立地類型的篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性尚不清楚，況且內(nèi)生真菌為專性共生菌，必須依靠與宿主植物建立共生關(guān)系并從中獲取宿主光合產(chǎn)物以維持正常生長(zhǎng)和發(fā)揮其功能(Burggraafetal., 1989)，研究?jī)?nèi)生真菌侵染對(duì)篤斯越橘礦質(zhì)元素的影響是明確內(nèi)生真菌與宿主植物共生的關(guān)鍵因素。對(duì)于篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性分析，以往多采用的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法存在自身局限性，一方面是部分真菌目前尚不能人工分離培養(yǎng) (袁繼鑫， 2013)，其次是分離過程中不同消毒時(shí)間分離得到的真菌數(shù)量差異顯著(何映霞等， 2008)，現(xiàn)代生物學(xué)高通量測(cè)序技術(shù)(ITS)為全面準(zhǔn)確地了解特殊立地環(huán)境中的微生物多樣性提供了便利(Hultmanetal., 2015)。因此，本研究在分子生物學(xué)鑒定和侵染特性分析相結(jié)合的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究篤斯越橘根系內(nèi)生真菌侵染率與宿主礦質(zhì)元素的相關(guān)性，旨在為研究?jī)?nèi)生真菌與宿主植物共生的生態(tài)學(xué)意義及合理開發(fā)利用篤斯越橘內(nèi)生真菌資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)區(qū)域概況及樣品采集

2015年8月，選取大興安嶺地區(qū)篤斯越橘集中分布的3種立地類型進(jìn)行調(diào)查分析，每種立地類型布設(shè)3個(gè)20 m×20 m的樣地，每個(gè)樣地選取1 m×1 m的標(biāo)準(zhǔn)樣方進(jìn)行調(diào)查并采樣，同時(shí)記錄各樣地的采集信息(表1)，參照尹德潔等(2011)的分類標(biāo)準(zhǔn)，將3種立地類型分為水濕地有土壤類型、水濕地?zé)o土類型、山地類型，由于本研究區(qū)域水濕地?zé)o土類型中永凍層距離地表較近，除大多根系分布于苔蘚層外，部分根系直接與永凍層接觸，因此在尹德潔等(2011)分類標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)地環(huán)境特點(diǎn)將其命名為水濕地凍土類型。其中，水濕地有土壤類型根系層主要為腐殖質(zhì)和沼澤土，主要伴生植物為興安落葉松(Larixgmelinii)、白樺(Betulaplatyphylla)、紅豆越橘(Vacciniumvitis-idaea)、杜香(Ledumpalustre)、忍冬(Loniceracaerulea)、柴樺(Betulafruticosa)； 水濕地凍土類型根系層主要為苔蘚，主要伴生植物為落葉松、紅豆越橘、杜香、柴樺、杜鵑(Rhododendronsimsii)； 山地類型根系層為少許腐殖質(zhì)和含有石塊的棕壤土，該立地類型中森林資源較豐富，主要伴生植物除水濕地有土壤類型的6種外，其伴生植物還有杜鵑。

在每個(gè)樣方內(nèi)隨機(jī)采集5株長(zhǎng)勢(shì)良好的篤斯越橘及根系分布層土壤，剪取部分直徑為0.5～1 mm的篤斯越橘根系洗凈混勻后，一部分固定于多聚甲醛固定液中，用于內(nèi)生真菌的侵染率計(jì)算及侵染結(jié)構(gòu)觀察； 一部分保鮮盒冷藏，帶回實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，用于內(nèi)生真菌多樣性分析； 剩余根系及植株地上部全部帶回實(shí)驗(yàn)室，用于植株礦質(zhì)元素含量測(cè)定； 土壤樣品揀出雜質(zhì)后帶回實(shí)驗(yàn)室自然晾干，用于土壤礦質(zhì)養(yǎng)分測(cè)定。

1.2篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性分析

1.2.1 根系樣品總DNA提取 取-80 ℃冰箱保存的根系，使用PowerSoil DNA Isolation Kit(Mibio，美國(guó))試劑盒并參照說明書進(jìn)行樣品根系總DNA提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 真菌ITS1區(qū)的擴(kuò)增采用引物ITS1-F(5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。擴(kuò)增體系(50 μL)： 模板DNA30 ng； 正反向引物(10 μM)各2 μL； 4 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1)； 5 μL 10×Pyrobest Buffer； 0.3 μL Pyrobest DNA Polymerase(2.5 U·μL-1, Takapa D Code: DR0055A)； 無菌ddH2O補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序： 95 ℃ 5min； 95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，25個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min； 4 ℃恒溫保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(電壓： 150 V； 電泳時(shí)間： 30 min)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單個(gè)樣品復(fù)雜性分析 基于OTUs(operational taxonomic units)的分析結(jié)果，試驗(yàn)對(duì)單個(gè)樣品進(jìn)行alpha 多樣性分析。真菌多樣性可用alpha 多樣性來表示，其alpha多樣性包括Shannon index(H′)，Phylogenetic diversity(PD, whole tree)和Observed number of species。其中，Observed number of species是用來表示實(shí)際觀測(cè)到的OTUs數(shù)目； Shannon index是用來評(píng)估反應(yīng)內(nèi)生真菌的物種數(shù)量及其分布的均勻度； Shannon index指數(shù)越大，物種越豐富。

1.3測(cè)定指標(biāo)及方法

多聚甲醛固定液中固定的根系順序經(jīng)10% KOH脫水透明、1% HCl酸化處理后，使用0.02%臺(tái)盤藍(lán)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌侵染結(jié)構(gòu)和計(jì)算真菌侵染率(Chapman, 1992)。

將自然風(fēng)干的土壤樣品除盡雜質(zhì)后過篩分級(jí)備用，用于測(cè)定土壤全N(凱式定氮法)，堿解N(堿解擴(kuò)散法)，全P(NaOH熔融-鉬銻抗比色法)，有效P(NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法)，全K、速效K(原子吸收火焰法)。篤斯越橘植株(地上部、地下部)在105 ℃殺青后恒溫至80 ℃烘干，經(jīng)粉碎、過篩后用于測(cè)定全氮(N)(凱式定氮法)，全磷(P)(NaOH熔融-鉬銻抗比色法)，全鉀(K)、鈉(Na)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、鐵(Fe)、錳(Mn)、鋅(Zn)、銅(Cu)(原子吸收火焰法)(鮑士旦， 2005)。采用Excel 2003處理原始數(shù)據(jù)，采用SAS 9.2軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)真菌侵染率與宿主礦質(zhì)養(yǎng)分的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析。

表1 大興安嶺3種立地類型中篤斯越橘分布狀況Tab.1 The V. uliginosum distribution conditions of three site types in the Greater Xing’an Mountains

2 結(jié)果與分析

2.13種立地類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性比較

篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性如圖1、2所示。Alpha多樣性分析表明，3種立地類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌OTUs在468～789之間(圖1A)，以水濕地凍土類型最高，山地類型次之，水濕地有土壤類型最低； 3種立地類型中的shannon index為H′=3.58～4.36(圖1B)，其中水濕地凍土類型H′=4.36，水濕地有土壤類型H′=3.58，說明水濕地凍土類型內(nèi)生真菌最豐富。如圖2所示，3種立地類型中鑒定出Phialocephala、Meliniomyces、Rhizoscyphus、Tomentella、Archaeorhizomyces、Cistella、Parmella、Oidiodendron、Clavaria9屬真菌，同一菌屬在不同立地類型中所占比例各異，其中山地類型和水濕地有土壤類型以Phialocephala為優(yōu)勢(shì)真菌，所占比例分別為40.1%、51.2%，水濕地凍土類型以Meliniomyces為優(yōu)勢(shì)真菌，所占比例為49.2%，以上兩類優(yōu)勢(shì)菌均屬于子囊菌(Hambletonetal., 2005; 鄧勛等， 2015)，說明篤斯越橘根系內(nèi)生真菌以子囊菌為優(yōu)勢(shì)菌。同時(shí)，由圖2還可以看出，部分內(nèi)生真菌表現(xiàn)出了明顯的立地類型特異性，如Cistella真菌僅分布于山地類型，占比2.53%，Tomentella真菌僅分布于水濕地凍土類型，而山地類型中未檢測(cè)出Meliniomyces真菌，為水濕地凍土類型中的優(yōu)勢(shì)菌屬(49.2%)，水濕地有土壤類型中未檢測(cè)出Oidiodendron真菌。

圖1 3種立地類型中篤斯越橘內(nèi)生真菌Alpha多樣性(n=3)Fig.1 Alpha diversity of endophytic fungi in V. uliginosum of three site types (n=3)A: Observed number of species； B: Shannon index

2.2篤斯越橘根系內(nèi)生真菌侵染特性

3種立地類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌侵染率差異顯著(Plt; 0.05)(圖3)，以水濕地凍土類型最高(68.09%)， 山地類型次之(62.33%—— 水濕地有土壤類型最低(54.98%)，這可能是因?yàn)樗疂竦貎鐾令愋椭泻V斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性最豐富(圖1C)，推測(cè)不同菌株間的相互作用可能對(duì)宿主植物的侵染具有促進(jìn)作用。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，3種立地類型中均有根外菌絲(圖4A)、胞間有隔菌絲(圖4B)、胞內(nèi)菌絲團(tuán)(圖4D)、表皮細(xì)胞缺失現(xiàn)象(圖4E)，而水濕地有土壤類型和山地類型中還出現(xiàn)胞間無隔菌絲的侵染結(jié)構(gòu)(圖4C)，5種侵染結(jié)構(gòu)中根外菌絲在3種立地類型中出現(xiàn)的頻次均最高。胞內(nèi)菌絲團(tuán)作為杜鵑花類菌根的典型侵染結(jié)構(gòu)(Peterson, 1980)，說明本研究區(qū)域的3種立地類型中篤斯越橘根系存在典型的菌根真菌侵染體； 而表皮細(xì)胞缺失現(xiàn)象可能是菌絲侵染宿主根系細(xì)胞一段時(shí)間后，根系中細(xì)胞原生質(zhì)膜破裂，細(xì)胞內(nèi)含物分解導(dǎo)致細(xì)胞缺失。

2.3篤斯越橘礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)及根系分布層土壤養(yǎng)分狀況

2.3.1 篤斯越橘常量元素含量 3種立地類型中篤斯越橘地上部、地下部常量元素含量分析結(jié)果(圖5)顯示，除Na和地上部P元素外，不同立地類型中篤斯越橘地上部、地下部礦質(zhì)元素含量均存在顯著差異(Plt; 0.05)，其中，地上部N、Ca元素含量高且差異較大，均以水濕地凍土類型含量最高，水濕地有土壤類型含量最低，而地上部及地下部Mg元素含量卻以水濕地有土壤類型最高，地上部以水濕地凍土類型最低(0.09%)，地下部以山地類型最低(0.07%)。由圖5可知，水濕地凍土類型的篤斯越橘地上部、地下部N、P、K、Ca元素含量顯著高于其余2種立地類型，而水濕地有土壤類型中地上部N、K、Ca，地下部N、P元素含量均最低，總體而言，水濕地凍土類型的植株礦質(zhì)元素含量較其余2種類型高，水濕地有土壤類型總體較低，說明立地類型對(duì)篤斯越橘吸收礦質(zhì)元素的影響較大。

2.3.2 篤斯越橘微量元素含量 由圖6可知，水濕地有土壤、水濕地凍土及山地3種立地類型中篤斯越橘地上部和地下部Mn元素含量均較高，但差異不顯著，其含量在742.88～776.81 mg·kg-1之間。除Mn和地下部Cu元素外，其余3種微量元素(Fe、Zn、Cu)含量在不同立地類型中差異顯著(Plt; 0.05)，其中水濕地凍土類型中地上部及地下部Fe元素含量均最高(地上部397.98 mg·kg-1，地下部593.31 mg·kg-1)，而Zn元素含量則最低； 水濕地有土壤類型中地上部及地下部Fe、Cu元素含量均最低，而Zn元素含量則最高，由此可知，篤斯越橘吸收微量元素具有地域間差異。

2.3.3 根系分布層土壤養(yǎng)分含量 由圖7可知，3種立地類型的篤斯越橘根系分布層土壤中，水濕地凍土類型的全N、全P、堿解N、有效P含量均最高，

圖2 3種立地類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of endophytic fungi species in V. uliginosum of three different types

圖3 3種立地類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌侵染率Fig.3 The colonization rate of endophytic fungi in V. uliginosum of three site types不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著(P lt; 0.05)，下同。 The different small letters show significant at 0.05 level. The same below.

圖4 3種立地類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌侵染結(jié)構(gòu)Fig.4 The infection structure of endophytic fungi in V. uliginosum of three site typesA： 根外菌絲 Exogenous mycelium； B： 胞間有隔菌絲 Intracellular hyphae with partition； C： 胞間無隔菌絲 Intracellular nonseptate hyphae group； D： 胞內(nèi)菌絲團(tuán) Intracellular hyphae； E： 表皮細(xì)胞缺失 Missing of the epidermal cells

圖5 3種立地類型中篤斯越橘地上部及地下部常量元素含量Fig.5 The V. uliginosum Macro elements content in aboveground and underground part of three site types

圖6 3種立地類型中篤斯越橘地上部及地下部微量元素含量Fig.6 The V. uliginosum Micro elements content in aboveground and underground part of three site types

圖7 3種立地類型中篤斯越橘根系集中分布層土壤養(yǎng)分含量Fig.7 The soil nutrient content of the V. uliginosum root centralized distribution layer of three site types

而全K和速效K含量則最低； 山地類型中的養(yǎng)分含量狀況則與水濕地凍土類型相反，即呈現(xiàn)全K、速效K含量最高，全N、全P、堿解N、有效P含量均最低。3種立地類型中，除全K和有效P外，其他各種養(yǎng)分在3種立地類型中均呈現(xiàn)不同程度的差異水平，其中，山地類型的全N含量與水濕地有土壤類型和水濕地凍土類型差異顯著(Plt; 0.05)，水濕地凍土類型的全P含量與水濕地有土壤類型和山地類型差異顯著(Plt; 0.05)。此外，水濕地有土壤類型中的堿解N、有效P、速效K含量分別為對(duì)應(yīng)全效養(yǎng)分的8.99%、17.7%、6.9%； 水濕地凍土類型中的堿解N、有效P、速效K含量分別為對(duì)應(yīng)全效養(yǎng)分的9.66%、14.51%、6.79%； 山地類型中的堿解N、有效P、速效K含量分別為對(duì)應(yīng)全效養(yǎng)分的12.17%、15.61%、7.42%，由此可知，水濕地凍土類型中有效P、速效K占對(duì)應(yīng)全效礦質(zhì)元素的比例均最低，說明該立地類型中可供植物吸收利用的有效養(yǎng)分含量相對(duì)較低。

2.4篤斯越橘礦質(zhì)元素間及其與根系內(nèi)生真菌侵染率的關(guān)系

對(duì)篤斯越橘礦質(zhì)養(yǎng)分和宿主植物根系內(nèi)生真菌侵染率的相關(guān)性分析(表2)發(fā)現(xiàn)，篤斯越橘植株N、P、K、Ca、Fe元素間呈顯著或極顯著正相關(guān)，但均與Zn元素呈極顯著負(fù)相關(guān)； 此外，Na元素與Mg元素顯著正相關(guān)，Ca元素與Mn元素顯著負(fù)相關(guān)。篤斯越橘植株礦質(zhì)元素含量與宿主植物根系內(nèi)生真菌侵染率的相關(guān)性分析結(jié)果(表2)顯示，宿主植物根系內(nèi)生真菌侵染率與植株N、P、K、Ca、Fe元素呈極顯著正相關(guān)，與Zn元素呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.944**)。由此可知，篤斯越橘體內(nèi)N、P、K、Ca、Fe元素間可能具有一定的相互促進(jìn)作用，而對(duì)Zn元素具有一定的抑制作用； 根系內(nèi)生真菌侵染可以促進(jìn)篤斯越橘植株對(duì)N、P、K、Ca、Fe元素的吸收，對(duì)Zn元素的吸收可能具有一定的限制作用。

表2 篤斯越橘礦質(zhì)養(yǎng)分含量與其內(nèi)生真菌侵染率間的相關(guān)性①Tab.2 Correlation of mineral elements of V. uliginosum and endophytic fungi colonization rate

①*Plt; 0.05;**Plt; 0.01.

3 討論

3.1篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性

大興安嶺地區(qū)3種立地類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌多樣性shannon index在3.58～4.36之間(圖1)，遠(yuǎn)高于已報(bào)道的南極苔蘚(H′=0.91～1.99)(Zhangetal., 2013)、維管植物(H′=1.44)(Rosaetal., 2010)和野生青檀(Pteroceltistatarinowii)(H′=2.05～2.32)(Chaietal., 2011)，說明大興安嶺地區(qū)篤斯越橘根系內(nèi)生真菌較為豐富，而不同立地類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌具有一定的立地類型特異性，如Cistella屬真菌僅在山地類型出現(xiàn)，Tomentella屬真菌僅出現(xiàn)于水濕地凍土類型，可能是因?yàn)閮?nèi)生真菌對(duì)篤斯越橘根系的侵染與不同時(shí)空環(huán)境及土壤等條件的變化有關(guān)(楊秀麗， 2010)。為深入探討土壤理化性質(zhì)對(duì)篤斯越橘根系內(nèi)生真菌侵染特性的影響，本研究對(duì)3種立地類型中的土壤理化性質(zhì)(全N、全P、全K、堿解N、有效P、速效K)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)3種立地類型中，除全K和有效P外，其余土壤養(yǎng)分在3種立地類型中呈現(xiàn)不同程度的顯著性水平(圖7)，說明不同立地類型中土壤養(yǎng)分差異使得篤斯越橘根系生理狀況及化學(xué)組成發(fā)生了變化(Carroll, 1988)，從而對(duì)部分內(nèi)生真菌的侵染產(chǎn)生地域特異性。ITS分析得到的9屬內(nèi)生真菌中，先前研究從杜鵑花科植物根系中分離得到Oidiodendron和Meliniomyces屬真菌(Berchetal., 2002; Bougoureetal., 2005)，并且Phialocephala屬真菌作為宿主植物根際重要的益生菌，具有促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)及增強(qiáng)宿主植物抗性等作用(鄧勛等， 2015)；Phialocephala、Meliniomyces、Oidiodendron、Cladophialophora、Devriesia、Cryptosporiopsis、Clavaria等真菌也相繼從不同宿主植物中分離得到(Petersonetal., 1980; Fisheretal., 1984; Seifertetal., 2004; Hambletonetal., 2005; Vohníketal., 2005; Daveyetal., 2007; Kowalskietal., 2011)，說明本研究區(qū)域的篤斯越橘資源是后續(xù)研究中選擇分離材料的較好樣本。此外，凍土環(huán)境中由于土壤受到低溫、供氧限制及養(yǎng)分可利用性等極端因素的影響，大部分生長(zhǎng)于凍土環(huán)境中的生物很大程度上是依靠根系微生物活性來適應(yīng)逆境環(huán)境(D’Amicoetal., 2006; Buzzinietal., 2012; Jansson and Tas, 2014; Beatetal., 2016)，本研究結(jié)果中水濕地凍土類型的內(nèi)生真菌多樣性最豐富與上述研究結(jié)果較一致，推測(cè)大興安嶺地區(qū)篤斯越橘根系內(nèi)生真菌是影響篤斯越橘生長(zhǎng)的重要因素。

3.2篤斯越橘根系內(nèi)生真菌侵染特性

宿主根系不但是共生真菌的生長(zhǎng)載體，還為共生真菌的生長(zhǎng)提供必要的生長(zhǎng)物質(zhì)，而共生真菌可從土壤中吸收礦質(zhì)養(yǎng)分供宿主植物生長(zhǎng)而被譽(yù)為“生物肥料”(劉潤(rùn)進(jìn)等， 2007)。本研究表明，3種立地類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌侵染率均較高且差異顯著(Plt; 0.05)，與前人研究結(jié)果較一致(Goulartetal., 1993; 袁繼鑫， 2013)，可能是本研究區(qū)域內(nèi)生真菌多樣性較豐富(圖1)，不同菌屬間的相互作用提高了侵染率； 而水濕地凍土類型中侵染率最高，可能是因?yàn)樵摿⒌仡愋椭刑μ\物質(zhì)較多，苔蘚中較多的活性物質(zhì)有利于真菌侵染宿主根系(唐雪東等， 2005)。此外，顯微觀察結(jié)果表明，3種立地類型中存在根外菌絲、胞內(nèi)有隔菌絲、胞內(nèi)無隔菌絲、胞內(nèi)菌絲團(tuán)、表皮細(xì)胞缺失現(xiàn)象等，說明不同真菌在篤斯越橘根系中可能形成不同的侵染結(jié)構(gòu)，而3種立地類型中均以根外菌絲的侵染結(jié)構(gòu)最豐富，根外菌絲在土壤中可形成類似于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的龐大菌絲體，菌絲可將各種植物的根系連接在一起，使宿主植物之間進(jìn)行物質(zhì)交換、能量流動(dòng)、信息傳遞，同時(shí)還可以改善土壤的物理化學(xué)性狀，從而提高土壤穩(wěn)定性，增加土壤肥力，改善植物根系生長(zhǎng)狀況(Miransari, 2010)。因此，后續(xù)試驗(yàn)中可選取本研究區(qū)域的篤斯越橘根系作為研究材料，通過分離培養(yǎng)手段獲得此類真菌，以此作為微生物菌肥應(yīng)用于篤斯越橘栽培中，降低篤斯越橘的栽培成本和減輕對(duì)環(huán)境的污染(Carrilloetal., 2015)。

3.3篤斯越橘礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)特性及其與內(nèi)生真菌侵染率間的相關(guān)性

菌根真菌對(duì)植物的促生長(zhǎng)作用已被廣泛研究，如外生菌根(Ectomycorrhiza, ECM)可促進(jìn)馬尾松對(duì)N、P、K元素的吸收及利用(高悅等， 2009)； 叢枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)能夠顯著促進(jìn)湖北海棠實(shí)生苗對(duì)P、Zn、Cu元素的吸收(Liu, 2005)； Morandi等 (1986)接種杜鵑花類菌根真菌1～4周后其宿主植物莖部、根部的生物量顯著增加。本研究表明，水濕地凍土類型中有效P、速效K占對(duì)應(yīng)全效礦質(zhì)元素的比例均最低，山地類型中堿解N、有效P、速效K含量占對(duì)應(yīng)全效礦質(zhì)元素的比例總體較高，但篤斯越橘礦質(zhì)元素含量并未與根系層土壤養(yǎng)分相對(duì)應(yīng)，反而水濕地凍土類型的篤斯越橘除Zn元素外，N、K、Ca、Fe元素含量均最高(圖5、6)，一方面可能是水濕地凍土類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌較豐富(圖1)，大量的菌絲可以擴(kuò)大宿主植物根系與土壤的接觸面而增加宿主的根際范圍，進(jìn)而促進(jìn)宿主吸收礦質(zhì)養(yǎng)分； 亦可能是水濕地凍土類型中大量的共生真菌可以產(chǎn)生廣泛的水解酶及氧化酶類，其對(duì)活化土壤中復(fù)雜的有機(jī)質(zhì)有重要作用(Bendingetal., 1996)，篤斯越橘根系真菌侵染率與其礦質(zhì)養(yǎng)分相關(guān)性分析結(jié)果與之對(duì)應(yīng)，即真菌侵染率與植株N、P、K、Ca、Fe元素含量呈極顯著正相關(guān)，與Zn元素呈極顯著負(fù)相關(guān)(表2)，說明篤斯越橘根系菌根真菌侵染可增加宿主植物體內(nèi)的N、P、K、Ca、Fe元素含量(Malmeretal., 2003; Scagel, 2005; 徐麗娟等， 2012)； 真菌侵染則減少篤斯越橘體內(nèi)Zn元素含量，與前人(Bradleyetal., 1981; Martinoetal., 2000; Martinoetal., 2002)對(duì)杜鵑花的研究結(jié)果較一致。此外，Mn元素含量在篤斯越橘地上部及地下部中均較高，這對(duì)于其它果樹可能引起中毒(安貴陽(yáng)等， 2004; 唐玉琴等， 2013)，但篤斯越橘能夠正常生長(zhǎng)，說明篤斯越橘對(duì)錳元素具有較強(qiáng)的耐性范圍。羅淑華(1997)研究發(fā)現(xiàn)，茶樹中Mn元素可促進(jìn)植物體內(nèi)硝態(tài)氮迅速轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，進(jìn)而合成氨基酸，當(dāng)植物吸收硝態(tài)氮時(shí)，其體內(nèi)Mn元素含量會(huì)相應(yīng)增加。對(duì)于大興安嶺地區(qū)篤斯越橘體內(nèi)高含量的Mn元素是否與茶樹中Mn元素的作用一致，有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

大興安嶺地區(qū)篤斯越橘根系內(nèi)生真菌種類較豐富(9屬)； 侵染率較高(54.98%～68.09%)； 侵染結(jié)構(gòu)多樣，ITS測(cè)序分析得到Phialocephala、Meliniomyces真菌是3種立地類型中篤斯越橘根系優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌，而不同立地類型中篤斯越橘根系內(nèi)生真菌具有一定的地域特異性； 篤斯越橘內(nèi)生真菌侵染能夠顯著增加宿主植物體內(nèi)N、P、K、Ca、Fe元素含量，而對(duì)宿主Zn元素的積累具有一定的抑制作用。因此，篩選不同立地類型中，尤其是不同根系養(yǎng)分水平下優(yōu)良的篤斯越橘根系內(nèi)生真菌群落，進(jìn)一步發(fā)掘利用，將對(duì)減少化肥污染乃至生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

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(責(zé)任編輯 王艷娜)

AnalysisontheCharacteristicsofEndophyticFungiandMineralNutrientofVacciniumuliginosumintheDaxing’anMountains

Bai Yongchao Chen Lu Wei Xufang Jiang Rundi Li Binbin Gong Zhongzhi Hou Zhixia

(KeyLaboratoryforSilvicultureandConservationAttachedtoChinaMinistryofEducationBlueberryResearchandDevelopmentCenterBeijingForestryUniversityBeijing100083)

【Objective】 This study was investigated endophytic fungi diversity,infection rate,infection structure,and host mineral nutrient content to understond the effects of endophytic fungi colonization on the mineral nutrition ofV.uliginosum.【Method】 This study was conducted in the Daxing’an Mountains area with three soil types: Mountain land type, Meadow bog permafrost soil layer type, Meadow bog with soil layer type. The diversity of root mycorrhizal fungi ofV.uliginosumwas analyzed by modern biological techniques (ITS). Multivariate statistical analysis was used to study the relationship between mycorrhizal colonization and host plant mineral nutrition.【Result】 1) The diversity of endophytic fungi (H′=3.58～4.36) and infection structure (exogenous mycelium, intracellular hyphae with partition, intracellular nonseptate hyphae group, intracellular hyphae, missing of the epidermal cells) were rich, the infection rate was high (54.98%～68.09%) onV.uliginosumroots in the Greater Xing’an Mountains. The endophytic fungi in the root system ofV.uliginosumin different site types had the specificity. Among them, the mountain land type and the meadow bog with soil layer type were dominated byPhialocephala, while the dominant species of the meadow bog permafrost soil layer type wasMeliniomyces. 2) Among the three site types, the endophytic fungi diversity and infection rate were the highest in the meadow bog permafrost soil layer type, followed by the mountain land type, and the meadow bog with soil layer type was lowest. The content of most mineral elements in the three site types showed the same trend as that root endophytic fungi diversity and infection rate, with the exception of Zn element inV.uliginosum. 3) The endophytic fungi infection rate was significantly or extremely significantly positively correlated with N, P, K, Ca and Fe content, but had an extremely negative correlation with Zn content (r=-0.944**).【Conclusion】 The endophytic fungi can significantly promote the mineral nutrient accumulation ofV.uliginosum, suggesting that the endophytic fungi colonization is an important factor affecting the mineral nutrient status ofV.uliginosum, and the environmental conditions was important factor influencing the diversity and abundance of endophytic fungi inV.uliginosumroots.

Vacciniumuliginosum； endophytic fungi； diversity； colonization status； mineral nutrient

10.11707/j.1001-7488.20171006

2016-09-30；

2017-05-09。

中央高校基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(YX2013-12)。

*侯智霞為通訊作者。

S718.83

A

1001-7488(2017)10-0050-10