高產漆酶白腐真菌的篩選

王玉俊+樊忠慧+王長寶+岳麗紅

摘要：以6種白腐真菌作為供試菌株，5種食用菌作為對照菌株，采用愈創木酚及α-萘酚基質平板顯色法，依據漆酶催化氧化還原反應產生顯色圈的直徑大小及變色程度對產漆酶菌株進行初篩；并采用ABTS酶活力測定法對菌株進行復篩。結果表明，11種真菌均具有分泌漆酶的能力，得到5株高產漆酶的白腐真菌菌株，由強至弱排列依次為朱紅栓菌[Trametes cinnabarina（Jacq.∶Fr.）Fr]、木蹄層孔菌[Pyropolyporus fomentarius（L. Ex F.）Teng]、單色云芝[Coriolus unicolor（L.∶Fr.）Pat]、輪紋韌革菌[Stereum ostrea（Bl. et Nees） Fr.]和寬鱗棱孔菌[Favolus squamosus（Huds.ex Fr.）Ames]，酶活力分別為23.47、20.26、19.52、18.39、17.93 U/mL。

關鍵詞：白腐真菌；漆酶；顯色直徑；酶活力

中圖分類號：Q939.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）21-4043-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.21.012

Screening of White Rot Fungi with High Laccase Yield

WANG Yu-jun，FAN Zhong-hui，WANG Chang-bao，YUE Li-hong

（College of Life Science，Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）

Abstract： With 6 kinds white rot fungi as test strains and 5 kinds edible fungi as control strain，the method of plate substrate chromogenic of Guaiacol and α-naphthol were adopted，the diameter of chromogenic and the degree of discoloration were compared，the secrete laccase strains were screened preliminary. And strains were screened for the second time by the method of ABTS laccase activity determination. The results showed that all kinds of fungi had the ability to secrete laccase. 5 strains of high yield laccase white rot fungi were obtained，and the rank（from high to low） of these 5 kinds of fungi on the laccase activity were Trametes cinnabarina，Pyropolyporus fomentarius，Coriolus unicolor，Stereum ostrea and Favolus squamosus，enzyme activities were 23.47 U/mL，20.26 U/mL，19.52 U/mL，18.39 U/mL，17.93 U/mL，respectively.

Key words： white rot fungi； laccase； chromogenic diameter； enzyme activity

漆酶能夠體外催化O-和P-聯苯酚、多酚、芳香胺、苯硫醇和酚類染料等的氧化反應，降解多環芳烴、木質素能力較強，在紙漿生物漂白、廢水處理、苯氧基類除草劑去毒等領域具有廣泛的研究和應用價值[1-5]。實際應用于生產的漆酶主要來源于白腐真菌，從白腐真菌中篩選出高產漆酶菌株對實現木質素的降解至關重要[6，7]。本試驗以6種白腐真菌作為供試菌株，5種食用菌作對照菌株，選用愈創木酚及α-萘酚基質為選擇性培養基，并通過ABTS酶活力測定試驗，篩選出高產漆酶優良菌株，為深入高產漆酶真菌的工業化開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 朱紅栓菌[Trametes cinnabarina （Jacq.∶Fr.）Fr]、木蹄層孔菌[Pyropolyporus fomentarius（L. Ex F.）Teng]、寬鱗棱孔菌[Favolus squamosus（Huds.ex Fr.）Ames]、輪紋韌革菌[Stereum ostrea（Bl. et Nees） Fr.]、單色云芝[Coriolus unicolor（L.∶Fr.）Pat]和平蓋靈芝[Ganoderma applanatum（Pers）Pat]，采集于黑龍江省涼水國家級自然保護區；蟹味菇[Hypsizygus marmoreus （Peck） H.E.Bigelow]、平菇[Pleurotusostreatus（Jacq ex Fr.）Quel]、杏鮑菇[Pleurotus eryngii （DC.ex.Fr.）Quel]、金針菇[Flammulina velutiper（Fr.）Sing]和滑子蘑[Pholiota nameko （Ito ex Imai）]，超市購買后純化分離。菌株均保存在佳木斯大學。

1.1.2 主要儀器 高壓蒸氣滅菌鍋（浙江新豐高壓滅菌鍋），303-1A培養箱（上海滬粵明科學儀器有限公司），DK-500水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），752N紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。endprint

1.1.3 藥品 葡萄糖（天津市凱通化學試劑有限公司），愈創木酚（天津市光復精細化工研究所），α-萘酚（上海展云化工有限公司），ABTS（酷爾化學科技有限公司）。

1.1.4 培養基 ①PDA培養基。馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，瓊脂15 g，用去離子水定容至1 L；②液體發酵培養基。馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，用去離子水定容至1 L；③0.03%愈創木酚-PDA培養基。1 L PDA培養基中加入0.3 g愈創木酚；④α-萘酚-PDA培養基。1 L PDA培養基中加入0.3 g α-萘酚。分裝于200 mL錐形瓶中，121 ℃下高壓蒸氣滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 產酶菌株的初步篩選 用打孔器分別取1.0 cm生長7 d的11種菌株接種于0.03%愈創木酚-PDA培養基上，28 ℃下培養7 d，菌落周圍呈紅褐色者為產酶陽性菌株，記錄與培養時間相對應的顯色直徑；用打孔器分別取1.0 cm生長7 d的11種菌株接種于α-萘酚-PDA培養基上，28 ℃培養7 d，菌落周圍呈藍色者為漆酶產生菌，記錄與培養時間相對應的顯色直徑。

1.2.2 高產酶白腐菌株的復篩 用打孔器分別取1.0 cm生長5 d的11種菌株接種于100 mL液體發酵培養基中，于28 ℃振蕩培養5 d后，過濾培養基，棄去濾渣。取2 mL濾液，加入2 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 5.0）和2 mL濃度為0.5 mol/L的ABTS。35 ℃下應用可見紫外分光光度計檢測420 nm波長處吸收值的變化，10 s間隔讀數，記錄1 min內吸收值的變化量，每種真菌進行3次平行重復，并計算漆酶活力（公式1）。在一定條件下，1 min內氧化1 μmol底物所需要的酶量為1個酶活單位（U）。

E=■ （1）

式中，E為酶活力，單位為μmol/（L·min）即U/mL，A1、A2為吸光度值變化的兩個端值，t為吸光度值從A1至A2所經歷的時間，K為稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 愈創木酚-PDA培養基顯色圈直徑比較

在其他條件一致的情況下，11種真菌在愈創木酚-PDA培養基平皿上培養7 d后，均有一定程度的顯色反應，顯色圈呈紅色，說明均具有分泌漆酶的能力，但顯色直徑及變色程度存在明顯差異（圖1）。顯色圈直徑大于5 cm的菌株有5個，由大到小排列依次為朱紅栓菌、木蹄層孔菌、寬鱗棱孔菌、輪紋韌革菌、單色云芝，其直徑分別為6.81、6.59、6.27、6.21、5.77 cm。

2.2 α-萘酚-PDA培養基顯色圈直徑比較

經過7 d的培養，11種真菌菌落周圍均形成不同直徑的藍色透明圈，說明均可分泌出漆酶（圖2）。顯色圈直徑較大的菌株（大于6 cm）有6個，由大到小排列依次為朱紅栓菌、木蹄層孔菌、平菇、輪紋韌革菌、單色云芝、寬鱗棱孔菌，其直徑分別為10.00、8.70、8.18、7.39、7.22、6.71 cm。

2.3 漆酶酶活力的比較

11種真菌均具有一定的分解ABTS的能力（圖3），漆酶活力最高的是朱紅栓菌，酶活力為23.47 U/mL，其次為木蹄層孔菌、輪紋韌革菌、單色云芝、寬鱗棱孔菌，酶活力依次為20.26、19.52、18.39、17.93 U/mL。以上5株白腐真菌產漆酶能力較強，而對照菌株產漆酶能力則相對較弱。

3 小結與討論

平皿顯色圈法是一種直觀、快速、靈敏的檢測漆酶活力的方法，一定程度上輔助了高產漆酶菌株的鑒別；漆酶可將ABTS分解為ABTS自由基，隨著ABTS自由基的增加，420 nm波長處吸光值也逐漸增大，根據420 nm波長處的紫外吸光值的檢測比較11種真菌所分泌漆酶的酶活力，ABTS漆酶酶活測定法靈敏度高，本試驗采用ABTS法進一步檢測真菌菌株產漆酶能力。朱紅栓菌、木蹄層孔菌、輪紋韌革菌、單色云芝和寬鱗棱孔菌在愈創木酚-PDA培養基和α-萘酚-PDA培養基上培養過程中，生長速度較快，顯色圈直徑較大，變色程度明顯，性狀比較穩定，它們產漆酶的能力遠遠超過其他菌株，分解ABTS速度較快。這5種白腐真菌分泌漆酶的酶活力均高于17.0 U/mL，其中，篩選的朱紅栓菌漆酶活力達23.47 U/mL，有研究報道[8]篩選的木腐菌株最高產漆酶能力為20.3 U/mL，朱紅栓菌產漆酶的能力高出前人報道菌株的15.6%。說明這5種白腐真菌產漆酶能力較強，在工業化應用方面，可作為高產漆酶菌株進行規模化培養，為今后高產漆酶真菌誘變育種及工程菌株的深入研究提供理論依據。

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