大株紅景天注射液對膿毒癥急性肺損傷小鼠肺組織核因子-κB表達的影響

張玉鳳 臧寶赫 李雪 趙文靜

大株紅景天注射液對膿毒癥急性肺損傷小鼠肺組織核因子-κB表達的影響

張玉鳳1，2臧寶赫1，2李雪1，2趙文靜1

目的觀察大株紅景天注射液對膿毒癥小鼠急性肺損傷的影響及可能機制。方法將72只雄性昆明小鼠隨機分為4組(n=18)：假手術組(Sham組)、急性肺損傷組(ALI組)、溶媒組(Vehicle組)、大株紅景天注射液組(Sofren組)。ALI組、Vehicle組和Sofren組用盲腸結扎穿孔法制備膿毒癥模型。Vehicle組和Sofren組分別于造模完成時立即腹腔注射溶媒或大株紅景天注射液4 mL/kg，以后每12h一次重復給藥。術后 12 h、24 h及48 h 取肺組織，行HE染色后光鏡下觀察肺組織病理損傷，Western blot法檢測肺組織磷酸化IκBα(P-IκBα)、IκBα，磷酸化NF-κBp65(P-p65)的表達。結果與Sham組相比，ALI組及Vehicle組肺損傷加重，P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表達明顯增加(Plt;0.05)；與ALI組相比，Sofren組肺損傷輕，P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表達明顯減少(Plt;0.05)。結論大株紅景天注射液減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷,其機制可能與抑制P-p65表達有關。

膿毒癥；急性肺損傷；NF-κB；IκBα

急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)是嚴重感染、休克、創傷等非心源性疾病過程中，肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致急性、進行性低氧性呼吸功能不全或衰竭。臨床上表現為進行性低氧血癥和呼吸窘迫。ALI和ARDS是同一疾病發展的不同階段，2012柏林定義摒棄ALI這一概念，根據氧合指數將ARDS分為輕、中、重三度[1]，但在動物模型中仍然沿用ALI這一概念。ARDS病因復雜，在眾多致病因素中，膿毒癥導致的ARDS發病率高、死亡率高，危害大[2]。研究表明大株紅景天注射液改善老年感染性休克及特發性肺纖維化患者動脈血氧分壓[3-4]。但具體分子機制尚不明確，本文從動物實驗角度探討大株紅景天注射液對膿毒癥致急性肺損傷的影響及可能機制。

資料與方法

一、實驗動物、藥品及主要試劑

清潔級雄性昆明小鼠72只，8-10周齡，體重30-35g，由徐州醫科大學實驗動物中心提供；大株紅景天注射液(批號：1001161001，通化玉圣藥業有限公司，中國)；磷酸化NF-κBp65抗體、磷酸化IκBα抗體、IκBα抗體、及β-Tubulin內參購自巴傲得生物科技有限公司。

二、動物分組和模型制備

健康昆明雄性小鼠72只，購自徐州醫科大學實驗動物中心。按隨機數字表法隨機分為4組(n=18)： Sham組、ALI組、Vehicle組、Sofren組。盲腸結扎穿孔致膿毒癥模型參照文獻[5]。具體步驟：腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉小鼠,仰臥位固定，沿腹正中線作1.5 cm切口。開腹后找到盲腸，在距盲腸末端1cm處結扎，用21G針頭穿通遠端腸壁兩次形成盲腸漏，然后將盲腸還納腹腔，逐層縫合。Sham組切開腹腔取出盲腸后還納并縫合，ALI組、Vehicle組和Sofren組采用盲腸結扎穿孔法制備膿毒癥模型。Vehicle組、Sofren組術畢分別腹腔注射雙蒸水、大株紅景天注射液4mL/kg,以后按每12小時一次重復給藥。

三、小鼠一般情況觀察

術后觀察小鼠活動、飲食、精神及呼吸等。

四、肺組織HE染色后病理學觀察

取肺組織10%甲醛固定24h,常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后行HE染色，于光學顯微鏡下觀察肺病理組織損傷。

五、肺組織P-IκBα、IκBα、P-p65 蛋白測定

取肺組織制備勻漿，提取細胞核蛋白及細胞漿蛋白：細胞漿蛋白用于P-IκBα和IκBα的測定，細胞核蛋白用于P-p65的測定。用Western blot法 檢測蛋白，蛋白樣品經電泳、轉膜、封閉、加一抗4℃孵育過夜，漂洗，加二抗室溫孵育2h，漂洗后，用BCIP/NBP堿性磷酸酯酶試劑盒顯色，采用Image J圖像分析系統定量分析。

六、統計學方法

結 果

一、一般情況

Sham組小鼠精神狀況及活動佳，飲食攝水正常，呼吸平穩。 ALI組及Vehicle組小鼠造模12h后出現倦怠、寒顫、豎毛、少動少食、腹瀉、眼角滲出物、膿性尿、口唇發紺、呼吸困難等表現。

二、肺組織病理學觀察

各組小鼠肺組織HE染色后光學顯微鏡下觀察：術后12、24及48 h，Sham組肺組織結構完好，肺泡清晰(見圖1A、1E、1I)；ALI組和Vehicle組肺組織病理變化明顯，可見肺泡破裂融合，肺泡間隔增厚，肺泡間隔及肺泡內炎癥細胞聚集(見圖1B、1F、1J，圖1C、1G、1K)；與ALI組相比，Sofren組肺泡結構破壞減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少，肺泡間隔未見明顯增厚(見圖1D、1H、1L)。

圖1 小鼠肺組織病理學改變(HE染色×200)

注： A-D為術后12h：A:Sham組,B:ALI組,C:Vehicle組,D:Sofren組; E-H為術后24h：E:Sham組,F:ALI組,G:Vehicle組,H:Sofren組; I - L為術后48h：I :Sham組,J:ALI組,K:Vehicle組,L:Sofren組。

三、 肺組織P-IκBα、P-p65蛋白表達變化

術后同一時間點，與Sham組相比，ALI組和Vehicle組P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表達明顯增加(Plt;0.05)；與ALI組相比，Sofren組P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表達明顯減少，Plt;0.05(見圖2-4)。

圖2 術后12h P-IκBα、IκBα及P-p65蛋白表達變化

注：與Sham組比較*Plt;0.05；與ALI組比較，#Plt;0.05

圖3 術后24h P-IκBα、IκBα及P-p65蛋白表達變化

注：與Sham組相比*Plt;0.05；與ALI組相比，#Plt;0.05

圖4 術后48h P-IκBα、IκBα及P-p65蛋白表達變化

討 論

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應綜合征，是導致急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的最常見病因。程曉明等[6]調查發現全身性感染是間接肺損傷的首要原因，近年來盡管抗感染治療和器官功能支持取得長足進步，但膿毒癥導致ARDS死亡率遠高于其他病因引起的ARDS，高達40.6%[2]。中心粒細胞肺內聚集和活化、炎癥介質釋放、氧化應激是ARDS的重要發病機制。研究發現氧化應激在ARDS發生發展中發揮重要作用，主要表現為促進肺泡上皮細胞及肺血管內皮細胞凋亡，從而導致肺泡毛細血管屏障功能障礙[7-8]。此外，NF-κB活化在肺血管內皮細胞及Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡中起重要作用[9-11]，同時氧化應激與NF-κB活化又可相互促進。

NF-κB/Rel是一種重要的轉錄因子，有5種Rel亞基：Rel(cRel)、RelA(p65，NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)[12]。NF-κB是由這5種亞基構成的同源或異源二聚體蛋白，P50- p65異二聚體是NF-κB最主要的二聚體形式；IκBα與NF-κB結合，抑制NF-κB轉位進入胞核。靜息狀態下NF-κB二聚體與IκBα結合以非活性形式存在于細胞質中[13]。在LPS、TNF-α、IL等刺激下，IκBα特定位點的絲氨酸殘基磷酸化、隨后范素化并降解，NF-κB暴露出核定位信號區，轉位進入胞核與特定目DNA序列結合，啟動相關基因的轉錄[12]。

大株紅景天注射液是從大株紅景天中提取的中藥注射液。既往研究表明紅景天具有抗氧化、抗凋亡、抗疲勞、心肌保護、改善認知功能、抗抑郁、調節免疫、抗增殖等藥理作用[14-20]。其抗氧化、抗凋亡及免疫調節作用可能對膿毒癥所致ARDS具有保護作用，因此本實驗選擇大株紅景天注射液，研究其對膿毒癥小鼠急性肺損傷的作用。大株紅景天注射液的主要有效成分是紅景天苷、酪醇、紅景天芬(又稱絡塞維)、紅景天任(又稱絡塞琳)等，體外實驗證實這四種成分均具有較強抗氧化能力，其中紅景天苷和酪醇具有明顯羥自由基清除作用[21]。Rahman等[22]發現氧化應激可以促進NF-κB的活化，進而影響IL-1、IL-6、TNFα等促炎基因的表達。本實驗研究結果顯示大株紅景天注射液減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷癥狀及肺組織病理學變化。盲腸結扎穿孔后小鼠肺組織胞漿蛋白P-IκBα表達增強，P-IκBα/IκBα增加，同時細胞核蛋白P-p65表達增加。腹腔注射大株紅景天注射液后，肺組織胞漿蛋白P-IκBα蛋白表達減少，P-IκBα/IκBα下降，細胞核蛋白P-p65表達減少。這些結果提示膿毒癥早期大株紅景天注射液可能是通過抑制NF-κB的活化，減輕膿毒癥相關急性肺損傷。

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EffectofsofreninjectiononNF-κBexpressioninacutelunginjurymicewithsepsis

ZHANGYu-feng,ZANGBao-he,LIXue,ZHAOWen-jingDepartment
Anesthesiology,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221009,China

ObjectiveTo observe the effect of sofren injection on septic acute lung injury in mice and its mechanism.Methods72 male Kunming mice were randomly divided into 4 groups (n=18): the sham group, the ALI group, the vehicle group, and the sofren injection group. Sepsis model was established by cecal ligation and puncture (CLP) in the group ALI, vehicle and sofren. In the group vehicle and sofren, 4mL/kg vehicle or sofren injection were intraperitoneally injected respectively after operation, followed by administration q12h. At 12, 24 and 48 h after operation, the whole lung were removed to observe the lung pathological damage after hematoxylin-eosin staining, and to detect the expression of P-IκBα, IκBα and NF-KBp65 (using Westen blot) in lung tissues.ResultsAs compared with the sham group, the pathological damage of lung and the level of P-IκBα, P-IκBα/IκBα and P-IκBα at 12, 24 and 48 h after operation were significantly increased in the ALI group (Plt;0.05). Compared with the ALI group, the pathological damage of lung and the level of P-IκBα, P-IκBα/IκBα and P-IκBα at each time were significantly decreased in the sofren group (Plt;0.05).ConclusionSofren injection inhibits the expression of P-p65, thus protects sepsis-induced ALI in mice.

sepsis; acute lung injury (ALI); NF-κB; IκBα

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.12.005

江蘇省 2009年度quot;六大人才高峰quot;D類資助項目(No 2009059)

1.221009 江蘇 徐州，徐州醫科大學附屬醫院 2.221009 江蘇 徐州，江蘇省麻醉學重點實驗室

趙文靜，Email:zhaowj886@sina.com

2017-04-07]