死亡谷芽胞桿菌NBIF-001防治番茄棒孢葉斑病研究

黃大野, 賁海燕, 曹春霞, 王開梅, 饒 犇, 劉曉艷*, 萬中義*, 楊自文

(1. 湖北省生物農藥工程研究中心, 武漢 430064; 2. 黑龍江省農業科學院園藝分院, 哈爾濱 150069)

死亡谷芽胞桿菌NBIF-001防治番茄棒孢葉斑病研究

黃大野1, 賁海燕2, 曹春霞1, 王開梅1, 饒 犇1, 劉曉艷1*, 萬中義1*, 楊自文1

(1. 湖北省生物農藥工程研究中心, 武漢 430064; 2. 黑龍江省農業科學院園藝分院, 哈爾濱 150069)

為明確死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株對棒孢葉斑病的防治效果,采用平板對峙結合顯微觀察確定其對多主棒孢的抑菌活性,并采用活體盆栽試驗研究該菌株對番茄棒孢葉斑病防治效果。結果表明,在平板對峙條件下NBIF-001對多主棒孢具有良好的抑菌活性,顯微鏡下觀察到菌絲發生扭曲、腫脹和變形;盆栽試驗結果表明 NBIF-001對棒孢葉斑病的防治效果達到71.46%。NBIF-001和50%啶酰菌胺WG聯用防治番茄棒孢葉斑病的效果明顯好于單獨施用50%啶酰菌胺WG，具有較明顯的增效作用,化學殺菌劑50%啶酰菌胺WG對NBIF-001菌株生長無明顯影響,兩者具有較好的相容性。

死亡谷芽胞桿菌; 棒孢葉斑病菌; 生防效果

番茄棒孢葉斑病是由多主棒孢Corynesporacassiicola引起的一種世界性病害,在多數番茄種植區域都有發生,近年來傳入我國,對我國番茄生產造成了嚴重的影響。多主棒孢除了侵染番茄,還能侵染黃瓜和茄子等蔬菜、花卉和橡膠等5 300余種植物[1-3]。目前,國內缺少針對多主棒孢的抗性品種,因此,防治該菌引起的病害主要依靠化學殺菌劑。但多主棒孢極易產生抗藥性,目前已經報道其對苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、乙霉威和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑產生抗藥性[4-6]。同時,化學殺菌劑的使用也會對人類健康和環境造成影響。基于上述原因,亟須更為安全有效的防治方法,近年來應用芽胞桿菌作為生防菌防控作物真菌和細菌性病害已經有大量報道,這些菌株從自然界中篩選出來,具有無污染無農藥殘留等優點,是一種理想的生防菌。

死亡谷芽胞桿菌BacillusvallismortisNBIF-001是由湖北省生物農藥工程研究中心分離和保存的具有高殺菌活力的菌株(中國典型培養物中心保存號為CCTCC No:M2015087),前期研究表明其對多種植物病原菌有良好的抑制作用,本文研究了其對番茄棒孢葉斑病的防治效果,以期為以后的田間示范和應用推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株:死亡谷芽胞桿菌B.vallismortisNBIF-001分離自云南香格里拉的松蘿根際土壤；番茄棒孢葉斑病菌由湖北省生物農藥工程研究中心分離保存。藥劑:50%啶酰菌胺水分散粒劑(WG),德國巴斯夫。番茄品種為‘中雜109’。

1.2 試驗方法

1.2.1 離體對峙試驗

死亡谷芽胞桿菌NBIF-001發酵液制備:將在冷凍甘油管保存的NBIF-001接種于LB液體培養基中,25℃,180 r/min振蕩培養18 h備用(飽和狀態下計數為108cfu/mL)。番茄棒孢葉斑病菌經PDA斜面活化5 d后用打孔器打取4 mm菌餅接種于PDA平板中央,在距離菌餅25 mm處等距離取4個點，每點接種NBIF-001 5 μL。以不接種NBIF-001作為對照,25℃培養6 d后觀察NBIF-001的抑菌效果。刮取抑菌帶邊緣棒孢葉斑病菌菌絲,在顯微鏡下(OLYMPUS CX21, Tokyo, Japan)觀察其與對照菌絲形態上的區別。

1.2.2 死亡谷芽胞桿菌防治番茄棒孢葉斑病及與啶酰菌胺聯用增效作用

多主棒孢C.cassiicola孢子制備方法按照Miyamoto等的方法[7]。將斜面保存的多主棒孢接種到PDA平板上,25℃黑暗培養10 d后用無菌手術刀片刮去菌絲,于25℃下采用BLB(black light blue)燈培養3 d使其產孢。刷取孢子溶于無菌水中,調整孢子濃度到104cfu/mL后備用。

NBIF-001發酵液的制備方法同1.2.1。試驗設4個處理:芽胞數為108cfu/mL的NBIF-001發酵液、NBIF-001發酵液108cfu/mL+50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL (有效成分)、50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL(藥劑對照)和清水(空白對照)。

溫室條件下播種催芽的番茄,常規管理下培養30 d后將各處理藥液噴施于番茄葉片表面至飽和,每處理3個重復,每個重復32株番茄。24 h后噴霧接種病原菌孢子懸浮液至滴水,25℃保濕培養3 d,統計各處理病情指數并計算防效。病害分級按照Ishii等的標準[6]。0級:無病斑,0.1級:病斑占葉面積小于1%,0.5級:病斑占葉面積1%～5%;1級:病斑占葉面積6%～10%;2級:病斑占葉面積11%～20%;3級:病斑占葉面積21%～30%;4級:病斑占葉面積31%～40%;5級:病斑占葉面積41%～50%;6級:病斑占葉面積51%～60%;7級:病斑占葉面積61%～70%;8級:病斑占葉面積71%～80%;9級:病斑占葉面積81%～90%;10級:病斑占葉面積大于90%。

病情指數=∑(各級植株數×級別)/(調查總株數×最高代表級別)×100;

防治效果(%)=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數×100。

1.2.3 死亡谷芽胞桿菌和啶酰菌胺相容性

將5%啶酰菌胺WG加入含有50 mL LB的三角瓶中,使其終濃度為50、100和200 μg/mL,以加入無菌水作為對照。隨后加入100 μL 108cfu/mL NBIF-001發酵液。25℃,180 r/min振蕩培養,在24、48和72 h后通過稀釋法測定各處理和對照菌落數,每個處理3次重復。

2 結果與分析

2.1 死亡谷芽胞桿菌NBIF-001對棒孢葉斑病菌離體抑制效果

離體對峙培養6 d后可以觀察到棒孢葉斑病菌和NBIF-001之間有明顯抑菌帶(圖1),在光學顯微鏡下可以觀察到,與對照菌絲相比,抑菌帶邊緣棒孢葉斑病菌菌絲發生扭曲和腫脹變形(圖2)。

圖1 死亡谷芽胞桿菌NBIF-001與棒孢葉斑病菌離體對峙培養Fig.1 Dual cultures between Bacillus vallismortis NBIF-001 and Corynespora cassiicola in vitro

圖2 多主棒孢菌與死亡谷芽胞桿菌NBIF-001對峙培養后其菌絲顯微形態Fig.2 Optical micrographs of Corynespora cassiicola in dual cultures with Bacillus vallismortis NBIF-001

2.2 死亡谷芽胞桿菌防治番茄棒孢葉斑病及與啶酰菌胺聯用增效作用

溫室盆栽試驗結果表明,死亡谷芽胞桿菌NBIF-001 108cfu/mL發酵液對番茄棒孢葉斑病具有良好的防治效果,施用后番茄植株的病情指數明顯低于對照,其防治效果略低于對照藥劑50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL的防治效果。

死亡谷芽胞桿菌NBIF-001 108cfu/mL與50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL聯合使用的防效高于單獨使用50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL的防效,但兩者之間差異未達到顯著水平。

表1死亡谷芽胞桿菌NBIF-001對棒孢葉斑病的防治效果1)

Table1ControleffectofBacillusvallismortisNBIF-001againstCorynesporaleafspotoftomato

處理Treatment病情指數Diseaseindex防效/%Controlefficacy死亡谷芽胞桿菌NBIF?001108cfu/mLB．vallismortisNBIF?001108cfu/mL25．4771．46b50%啶酰菌胺WG100μg/mLboscalid50%WG100μg/mL19．8977．72abNBIF?001108cfu/mL+50%啶酰菌胺WG100μg/mLNBIF?001108cfu/mL+boscalid50%WG100μg/mL10．7587．96a對照Control89．26-

1) 同列數據具有不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

圖3 NBIF-001發酵液對番茄棒孢葉斑病的防治效果Fig.3 Control effect of fermentation broth of NBIF-001 on Corynespora leaf spot of tomato

2.3 NBIF-001菌株與啶酰菌胺相容性

當NBIF-001菌株在含有50、100和200 μg/mL 50%啶酰菌胺WG的LB液體培養基中振蕩培養時,各濃度處理下NBIF-001的菌落數與清水對照差別較小。24 h后各處理和對照的NBIF-001生長均接近飽和。這些結果顯示啶酰菌胺對NBIF-001菌株生長沒有影響(圖3)。

圖4 死亡谷芽胞桿菌NBIF-001在含不同濃度啶酰菌胺的LB液體培養基中的生長情況Fig.4 Growth of Bacillus vallismortis NBIF-001 in LB liquid medium with different concentrations of boscalid

3 結論與討論

芽胞桿菌是土壤中重要的生物群體,其生長快,所需營養簡單,易分離培養,抗逆性強,可作為生防菌劑[8]。田間應用表明芽胞桿菌生防菌劑在穩定性、與化學農藥的相容性等方面明顯優于其他生防菌[9]。

多主棒孢極易產生抗藥性,研究表明,在黃瓜大棚中,同一化學藥劑連續噴施3次以上,多主棒孢抗藥性菌株出現的幾率顯著增加。因此,在棒孢葉斑病的防治過程中減少殺菌劑的使用頻率和劑量才能抑制抗藥菌株的出現[7]。作者前期研究表明,我國由多主棒孢引起的蔬菜棒孢葉斑病對多菌靈產生了嚴重的抗藥性,使之不能用于棒孢葉斑病的防治,推測可能是由于種子帶菌長距離傳播造成抗性種群的擴散[10]。因此尋找其他防治方法顯得極為重要,芽胞桿菌作為生防因子是進行抗性菌株治理的重要途徑。

NBIF-001菌株對多主棒孢具有良好的防治效果,與啶酰菌胺聯用具有明顯的增效作用和良好的相容性,生產上可以與其進行交替或混合使用,有利于緩解抗性壓力。其作用機理、發酵條件、劑型加工、應用技術田間防治效果等需要進一步的研究,為今后的產品開發和應用奠定基礎。

[1] 高葦, 李寶聚, 石延霞, 等. 多主棒孢菌在黃瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化[J]. 園藝學報, 2011, 38(3):465-470.

[2] 古松, 高先愛, 楊和平, 等. 黃石市設施蔬裝棒孢葉斑病的發生特點與防治技術[J]. 中國蔬菜, 2016(3): 80-81.

[3] Smith L J, Datnoff L E, Pernezny K, et al. Phylogenetic and pathogenic characterization ofCorynesporacassiicolaisolates.[C]∥International Symposium on Tomato Diseases, 2009: 8-12.

[4] Hasama W, Morita S, Kato T.Control ofCorynesporatarget leaf spot of cucumber by use of negatively-correlated cross resistance between benzimidazole fungicides and diethofencarb[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 1991, 57: 319-325.

[5] Date H, Kataoka E, Tanina K, et al. Sensitivity ofCorynesporacassiicola, causal agent ofCorynesporaleaf spot of cucumber, to thiophanate-methyl, diethofencarb and azoxystrobin [J].Japanese Journal of Phytopathology,2004,70(1):10-13.

[6] Ishii H, Yano K, Date H, et al. Molecular characterization and diagnosis of QoI resistance in cucumber and eggplant fungal pathogens [J]. Phytopathology, 2007, 97(11): 1458-66.

[7] Miyamoto T, Ishii H, Seko T, et al. Occurrence ofCorynesporacassiicolaisolates resistant to boscalid on cucumber in Ibaraki Prefecture, Japan [J]. Plant Pathology, 2009, 58(6):1144-1151.

[8] 孫正祥, 紀春艷, 李云峰, 等. 香蕉枯萎病拮抗細菌的分離利選與鑒定[J]. 中國生物防治, 2008, 24(2): 143-147.

[9] Oostendorp M, Sikora R A.Seed treatment with antagonistic rhizobacteria for the suppression ofHeteroderaschachtiiearly root infection of sugar beet [J]. Revue Némato, 1989, 12(1): 77-83.

[10] Huang D Y, Shi Y X, Xie X W, et al. Sensitivity ofCorynesporacassiicolato carbendazim and diethofencarb [J]. Journal of Pure and Applied Microbiology, 2013, 7(2): 891-898.

(責任編輯： 楊明麗)

ControleffectofBacillusvallismortisNBIF-001onCorynesporaleafspotoftomato

Huang Daye1, Ben Haiyan2, Cao Chunxia1, Wang Kaimei1, Rao Ben1, Liu Xiaoyan1, Wan Zhongyi1, Yang Ziwen1

(1.HubeiBiopesticideEngineeringResearchCenter,Wuhan430064,China; 2.HorticulturalBranch,HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150069,China)

In order to evaluate control effect ofBacillusvallismortisNBIF-001 onCorynesporaleaf spot, the inhibition activity was tested by dual culture method and microscope observation, and the control efficacy was investigated by pot experiment. The results showed that the strain NBIF-001 had high inhibition activity in dual culture, hypha deformed and cytoplasmic vacuoles enlarged. Pot experiment demonstrated that NBIF-001 exhibited a better control effect onCorynesporaleaf spot of tomato with the efficacy of 71.46%. NBIF001 combined with boscalid 50% WG had obvious synergic effect on the disease control. Bocalid showed no significant effect on the growth of NBIF-001, thus they both had the good compatibility.

Bacillusvallismortis;Corynesporaleaf spot; biological control effect

2017-02-07

2017-05-24

湖北省自然科學基金重點項目(2016ABA103)；國家重點研發計劃(SQ2017ZY060083)；湖北省農業科技創新中心創新團隊項目(2016-620-000-001-038)

* 通信作者 E-mail：xiaoyanliu6613@163.com；wanzhongyi1964@126.com

S 476, S 436.412

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.034