基于近紅外技術柑橘黃龍病田間快速檢測方法研究

饒 敏, 桂家祥, 盧占軍, 肖青青, 張 岑

(1.江西省贛州出入境檢驗檢疫局, 贛州 341000; 2.國家臍橙工程技術研究中心, 贛州 341000;3. 廣東訊動網絡科技有限公司, 廣州 510000)

基于近紅外技術柑橘黃龍病田間快速檢測方法研究

饒 敏1, 桂家祥1, 盧占軍2, 肖青青3, 張 岑1

(1.江西省贛州出入境檢驗檢疫局, 贛州 341000; 2.國家臍橙工程技術研究中心, 贛州 341000;3. 廣東訊動網絡科技有限公司, 廣州 510000)

柑橘黃龍病在感病植株和健康植株之間傳播速度快，因此快速檢測柑橘黃龍病對其防治十分關鍵。本文研究了近紅外技術快速檢測柑橘黃龍病的方法。采用PLS-LDA建立的模型對未參與建模的樣品進行了檢測，結果表明，該模型檢測的準確率與普通PCR檢測的結果符合率達到100%，假陽性率小于1%。該技術具有檢測周期短、無污染等優點，可用于田間黃龍病的快速檢測。

近紅外光譜技術; 柑橘黃龍病; 田間快速檢測; PLS-LDA

黃龍病是柑橘生產上最具毀滅性的病害,其防治的有效措施是清除病源,切斷傳播媒介[1]。簡便、準確的田間快速檢測技術是目前柑橘黃龍病防控亟須解決的問題。柑橘黃龍病的診斷方法主要有田間癥狀診斷、指示植物鑒定、PCR生物技術檢測(即DNA檢測)[2]等。田間癥狀鑒別簡便、直接,一旦柑橘樹葉片出現斑駁狀黃化,掛果期出現“紅鼻子果”,即可斷定是黃龍病樹;但未表現典型發病癥狀的植株易與生理黃化相混淆,導致錯誤診斷。指示植物鑒定周期長,難以用于實際生產;DNA檢測雖然準確,但需要在實驗室完成,無法滿足現場、快速的檢測需求。

近紅外光是最早發現的不可見光,20世紀90年代以來,以近紅外光為基礎的光譜分析技術得到較快發展,并廣泛應用于農業、石油化工、食品工業、制藥工業及臨床醫學等領域。將近紅外光譜(near infrared,NIR)應用于柑橘黃龍病檢測也有了一些初步研究[3-9]。最早開展柑橘黃龍病紅外光譜檢測研究的是美國佛羅里達大學,研究者分別對感染黃龍病的柑橘植株和缺鋅、缺錳植株的葉片進行近紅外和中紅外區光譜掃描分析,發現感染黃龍病的葉片在近紅外區具有一定的特征,可用于柑橘黃龍病快速檢測[4]。目前對處于潛伏期的黃龍病樣品的快速檢測方法還沒有相關的研究,同時在儀器上缺乏規模化、便攜式的近紅外光譜儀器。近紅外技術在檢測黃龍病上具有快速,無損,可重復等優點[10-13],可在實際中為種植戶提供指導,具有良好的效果和廣闊的應用前景。

本研究在已有研究成果的基礎上,就NIR應用于柑橘黃龍病田間快速檢測方法進行了深入的算法優化,對黃龍病潛伏期樣品進行了近紅外檢測,同時對開發規模化和便攜化的近紅外黃龍病專用檢測儀進行了研究,并對研究成果進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用葉片材料均采自于國家臍橙工程技術研究中心。所采葉片類型包括：有癥狀,經PCR檢測鑒定為感染黃龍病的葉片;經PCR檢測感病,但田間未顯癥的葉片;田間表現缺素癥狀葉片(主要為缺鋅、氮、鎂元素),共計1 800個樣品。

1.2 儀器設備

光譜儀器采用廣州訊動網絡有限公司開發的NGD-U1模塊,該模塊采用最新的MEMS微鏡技術原理,波長范圍900～1 700 nm,儀器輕便,適宜田間現場檢測。

1.3 試驗方法

采集葉片近紅外光譜:擦干樣品葉片,使其干凈無污漬,不采集葉脈位置。在同一葉片,通過上述光譜儀正反兩面各采集3個點,得到該葉片的反射率。通過化學計量學軟件,建立鑒別模型。

2 結果與分析

2.1 光譜信息

感染黃龍病葉片、潛伏期黃龍病葉片以及未感染葉片原始光譜圖及二階導數光譜圖如圖1、圖2。

圖1 不同樣品葉片原始光譜圖Fig.1 Original spectra of different leaves

圖2 不同樣品葉片二階導數光譜圖Fig.2 Second derivative spectra of different leaves

從圖1、圖2上可看出,感染與未感染葉片的光譜特征區域主要分布在1 300 ～ 1 500 nm 范圍內,潛伏期與已顯癥葉片光譜圖均有明顯特征,易于識別。通過采用化學計量學方法[14-16],對近紅外數據進行多元散射校正(MSC法),消除葉面散射以及光程變化對NIR漫反射光譜的影響,可以提煉出感染黃龍病的特征信息,進而識別出是否感染。

2.2 方法篩選

NIR 應用于柑橘黃龍病快速檢測依據NIR在定性分析中 “相似相聚”的原理,通過不同的模式識別方法將同類樣品聚在一起,對不同的樣品進行分離,從而對樣品的類別進行判定[18-19]。通過化學計量學軟件,對樣品光譜數據進行主成分聚類分析,得到如下聚類圖,如圖3。從圖3中可以看出,黃龍病樣品與未感染樣品有明顯界線,說明近紅外方法檢測黃龍病是可行的。

圖3 不同樣品葉片聚類分析Fig.3 Cluster analysis of different leaves

近紅外光譜分析技術的定量定性分析都需建立在化學計量學基礎上,為了更好地建立黃龍病判別分析模型,需進行相應的算法優選,本試驗挑選目前較常用的集中判別分析算法,K-最近鄰域(KNN)、隨機森林(random forests)、樸素貝葉斯、集成學習方法和偏最小二乘法-線性判別分析(PLS-LDA)分別建立模型,按6次隨機樣品分類,識別率結果見表1。將收集到的樣品劃分為建模集和檢驗樣品集。建模集用于確定近紅外定量模型的參數,然后采用不參與建模過程的檢驗樣品集對優選的模型進行檢驗。根據模型的可用性來評價模型預測未知樣品的能力,本研究采用的評價指標為識別率(recognition rate)。識別率(%)=預測準確的樣品個數/總樣品數×100,識別率越大,說明模型的性能越好。

表1不同分析方法的識別率

Table1Recognitionrateofdifferentanalyticalmethods

隨機次數Randomtimes識別率/% AccuracyK鄰近算法KNN隨機森林法Randomforests樸素貝葉斯Naivebayes集成學習方法Ensemblelearningmethods偏最小二乘線性判別分析PLS?LDA198．4293．1664．7492．11100．00299．4793．1661．0592．1199．47398．4297．8970．5393．1699．47497．8994．2166．8491．5899．47597．8990．0069．4785．79100．006100．0092．1165．7986．8499．47

表1顯示,5個定性分析算法中PLS-LDA的準確率和穩定性最好,所以本研究選擇該方法作為柑橘黃龍病檢測的建模方法,并以此為基礎進行模型優化、完善和驗證。

不同的預處理方法對光譜信息的提取會有不同,本研究對比了歸一化、標準化、標準正態分布(SNV)、多元散射校正(MSC)、SG一階導數、SG二階導數等六種方法預處理后的建模差異,其識別率結果見下表2。

表2不同預處理方法的識別率

Table2Recognitionrateofdifferentpretreatmentmethods

預處理方法Pretreatmentmethod項目Item主因子數Principalfactor黃龍病識別率/%RecognitionrateofHLB未感染葉片識別率/%Recognitionrateofuninfectedleaves總識別率/%Totalrecognitionrate原始光譜Originalspectrum模型Model檢驗Test2099．899．799．799．080．089．5歸一化Normalization模型Model檢驗Test1999．899．699．7100．084．092．0標準化Standardization模型Model檢驗Test1999．899．799．783．079．081．0標準正態分布SNV模型Model檢驗Test2099．999．599．799．087．093．0多元散射校正MSC模型Model檢驗Test2099．899．699．799．091．095．0SG一階導數Firstderivative模型Model檢驗Test2099．999．799．887．063．075．0SG二階導數Secondderivative模型Model檢驗Test2099．399．299．281．063．072．0

表2顯示,6個預處理方法中MSC法的識別率最好,MSC具有消除葉面散射以及光程變化對NIR漫反射光譜的影響,所以本研究選擇該預處理方法,并以此為基礎進行模型優化、完善和驗證。

2.3 模型應用

為提高PLS-LDA模型的準確率,對建模的預處理方法和建模波段進行了優化,采用優化后的模型對720個未參與建模的樣品(包括傳統PCR檢測方法判定為黃龍病的樣品340個,未感染黃龍病樣品380個)進行判定,結果(表3,圖4)表明,經近紅外方法預測判定黃龍病結果準確識別率達到100%,假陽性率小于1%。通過上述方法建立的柑橘黃龍病檢測模型在黃龍病快速檢測系統中只需10 s就能得到檢測結果,并且該方法對潛伏期黃龍病檢測有效,大大減少了人為誤判的可能性。試驗驗證了近紅外光譜法與經典檢測方法結果無顯著差異,并初步通過實踐應用證明其在田間快速檢測上的可行性和實用性。

表3PLS-LDA模型預測黃龍病識別率
Table3RecognitionratesofHuanglongdiseasebyPLS-DLAmodel

樣品類別TypePCR鑒定結果/個ResultofPCRPLS?LDA鑒定結果/個ResultofPLS?LDA識別率/%Recognitionrate感染黃龍病葉片LeaveinfectedbyHuanglongdisease340340100未感染葉片Uninfectedleave38037999．7388

圖4 優化模型對樣品的判定結果Fig.4 Results of the optimization model for the samples

3 結論與討論

NIR技術是一種快速、無污染的新型快速檢測技術,本研究表明,通過優選預處理、建模算法能將黃龍病快速檢測模型判定柑橘黃龍病陽性與普通PCR陽性的符合率提升至100%,近紅外預測值與傳統PCR檢測技術方法的檢測結果無顯著差異。便攜式近紅外光譜儀結合化學計量學PLS-LDA算法,能夠逐步地應用于柑橘黃龍病田間快速檢測,從而對柑橘黃龍病的整個生產過程進行全程檢測和監控,該技術具有很大的發展空間和推廣前景。

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(責任編輯： 楊明麗)

FastdeterminationofHuanglongbingdiseaseinthefieldbynearinfraredspectroscopy

Rao Min1, Gui Jiaxiang1, Lu Zhanjun2, Xiao Qingqing3, Zhang Cen1

(1.GanzhouEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Jiangxi341000,China; 2.NationalNavelOrangeEngineeringResearchCenter,Ganzhou341000,China; 3.GuangdongXundongScienceandTechnologyLtd.,Guangzhou510000,China)

It is very important to develop rapid detection method for Huanglongbing (HLB) disease, because of the rapid spread of the disease. In this paper, the near infrared technique was applied for rapid detection of HLB. The model of PLS-LDA was used to detect the samples which did not participate in the modeling. The accurate rate of this technique was 100% same with that of PCR, and the false positive rate was less than 1%. Field detection showed that the near infrared technique for HLB rapid detection is feasible and practical, and can be used in the field detection of HLB disease, with the advantages of short detection cycle, no pollution, etc.

near infrared spectroscopy; citrus Huanglongbing disease; rapid detection in the field; PLS-LDA

2017-02-23

2017-05-23

江西省科技計劃項目(20152ACF60003,20151BBG70067,20141BBF60053);江西省科研院所基礎設施項目(20151BBA13045);國家自然科學基金(31560602)

聯系方式 E-mail:gzrm@qq.com

S 436.66

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.022