柴胡斑枯病病原及其生物學特性

王 艷, 晉 玲, 曾翠云, 雒 軍, 朱田田

(甘肅中醫藥大學, 蘭州 730000)

柴胡斑枯病病原及其生物學特性

王 艷, 晉 玲, 曾翠云, 雒 軍, 朱田田

(甘肅中醫藥大學, 蘭州 730000)

據2011-2014年調查,甘肅省柴胡斑枯病發生嚴重,常年發病率為13%～21%,嚴重度1～2級。本研究以形態學和分子生物學方法相結合,明確了甘肅省柴胡斑枯病病原及其生物學特性。甘肅省柴胡斑枯病菌分生孢子器近球形或球形,黑褐色,高66.4～90.2 μm,平均77.5 μm;直徑57.3～90.0 μm,平均70.5 μm。分生孢子針形、無色,有些稍彎曲,具1～3隔膜,大小(13.0～26.0)μm×(1.5～3.0)μm,平均19.0 μm×2.0 μm。通過ITS、LSU、RBP2和β-tubline多基因位點構建系統發育樹,將柴胡斑枯病病原鑒定為柴胡殼針孢SeptoriabupleuricolaSacc.。該菌菌絲生長、分生孢子萌發和產孢的溫度范圍分別為0～35℃、0～35℃、5～35℃,最適溫度分別為20～25℃、15℃、10～15℃;連續光照有利于菌絲生長、孢子萌發和病菌產孢;菌絲生長、孢子萌發和產孢的適宜pH范圍分別為4.0～10.0、4.51～9.19和5.0～9.0,最適pH分別為5.0、6.49和5.5;此菌在相對濕度75%以上可萌發,以水中萌發最好;柴胡葉或根漬液對孢子萌發有較強的促進作用。表明柴胡殼針孢菌絲生長和孢子萌發的適宜溫度偏低,因此該病害在氣溫偏低及持續陰雨結露條件下發生較重。

柴胡斑枯病; 形態學; 分子生物學; 病原鑒定; 生物學特性

柴胡BupleurumchinenseDC.屬傘形科多年生草本植物[1],為我國常用大宗藥材,始載于《神農本草經》,列為上品,以根入藥,性味苦、微寒,具疏散退熱,升陽,舒肝等功效,主治瘧疾,肝郁氣滯,胸肋脹痛等癥[2]。主產于我國東北、華北、內蒙古、河南、陜西及甘肅等省區,多為野生[3]。由于長期過度采挖,野生資源不能滿足市場需要,中國從20世紀80年代初開始研究野生變家種試驗[4]。甘肅省是柴胡的道地產區之一,經調查,甘肅省定西市、隴南市以及河西地區均有大面積種植,僅定西市的隴西縣柴胡種植面積就達到約2 000 hm2,隴南一帶的禮縣、清水縣,河西地區的金昌、天祝、武威等地種植規模也在400 hm2,使甘肅的柴胡產量躍居全國之首[5],2012年甘肅柴胡種植面積達19 090 hm2,年產量達4.34萬t,占全國的50%[6]。

但是隨著栽培面積逐年增大,柴胡病害發生日趨嚴重,國內記載柴胡病害主要有斑枯病SeptoriabupleuriSacc.[7-9]、殼二孢葉斑病AscochytabupleuriThüm.[9]、銹病PucciniabupleuriRudolphi[10]、根腐病FusariumoxysporumSchl.[11]、Rhizoctoniasp.[12]和鏈格孢葉斑病Alternariaalternata(Fr.:Fr.) Keissl.[13]。在2011-2014年甘肅省藥用植物病害調查中,發現斑枯病是甘肅省柴胡生產中的主要病害,甘肅省定西地區隴西縣、靈臺縣、渭源縣、漳縣及安定區都有發生,發病率平均13%～21%,嚴重度1～2級[12]。作為柴胡栽培過程中影響柴胡質量和產量的重要病害,國內僅對其病原進行了記載,但是對該病害的發生危害情況,病原的生物學特性及病害的防治措施等均無系統的研究報道。本研究旨在對該病的病原進行研究,測定其生物學特性,同時提出一定的防治建議,為柴胡規范化種植以及斑枯病的有效防治提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種:2007年10月采自甘肅中醫藥大學藥材示范園的柴胡斑枯病新鮮標樣,經分離培養后鏡檢確定為殼針孢屬真菌Septoriasp.,純化后接種健康柴胡葉片發病的病菌,再次分離后,于4℃下保存備用。

1.2 方法

1.2.1 病原形態觀察

從采集的柴胡斑枯病病葉組織上挑取病原分生孢子器,置于載玻片上,以水為浮載劑,在光學顯微鏡下觀察并測定分生孢子器20個,分生孢子30個,分別取最大值和最小值作為該指標的上限和下限,同時觀察菌株在PDA、OA和MEA培養基[14]上,于25℃下黑暗培養20 d的培養性狀,并利用冷凍切片機對分生孢子器進行切片,觀察分生孢子器內部結構,再參照相關資料[7-9]鑒定病原。

1.2.2 病原菌DNA提取及系統發育樹的構建

取在PD培養液中于20℃、45 r/min振蕩培養7 d的柴胡斑枯病病原菌菌絲在液氮中研磨,用UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(SK1375,上海生工)提取DNA。ITS、LSU、RBP2和β-tubline 4個片段的PCR擴增分別采用引物ITS1/ITS4、LROR/LR5[15]、fRPB2-5f/fRPB2-7cR[16]、T1/β-Sandy-R[17-18]。50 μL PCR反應體系:10×PCR Buffer(含MgCl220 mmol/L)5 μL、dNTPs 10 mmol/L 0.5 μL、10 μmol/L引物各2.5 μL、2 U/μLTaq4 μL、模板DNA 2 μL。PCR擴增條件:95℃預變性3 min;94℃變性30 s,分別以53℃(ITS、LSU),55℃(RBP2),52℃(β-tubulin)退火45 s,72℃延伸1 min,共30個循環;最后72℃延伸8 min,4℃保存。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳,用凝膠成像儀進行觀察并照相。PCR產物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化和測序。并用BioEdit[19]軟件反復校對,去除兩端不確定的序列后,在GenBank中進行BLASTn比較搜索,下載相似序列并進行多基因片段的拼接,選用Readeriellamirabilis作為外群(菌株號:CBS125000;ITS、LSU、RBP2和β-tublin在GenBank登錄號分別為:KF251332、KF251836、KF252335和KF252804)。MEGA 6.0軟件采用鄰接法構建系統發育樹。

1.2.3 柴胡斑枯病菌生物學特性測定

1.2.3.1不同溫度對菌絲生長、產孢量及孢子萌發的影響

在已培養30 d的菌落邊緣打取直徑為7 mm的菌餅接種于PDA平板上,分別置于5、10、15、20、25、30、35℃溫度下培養,每溫度處理重復3皿。每隔4 d用十字交叉法測定菌落大小,20 d后測定產孢量。孢子量測定采用血球計數板計數;孢子萌發采用懸滴培養,每溫度處理重復3次,定時觀察孢子萌發率,每重復觀察計數5個視野約300個孢子,統計其萌發率。

1.2.3.2不同光照對菌絲生長、產孢量及孢子萌發的影響

將菌餅接種于PDA平板上,置25℃連續光照,光暗12 h交替及連續黑暗條件下培養;將孢子懸浮液于20℃在上述光照條件下懸滴培養,其他同上。

1.2.3.3不同pH對菌絲生長、產孢量及孢子萌發的影響

將菌餅接種于由NaOH和HCl調制的pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的PDA培養基平板上,25℃下培養;用檸檬酸-磷酸二氫鉀緩沖液配制pH為4.51、5.58、6.49、7.00、7.41、8.39、9.19的孢子懸浮液,20℃下懸滴培養,其他同上。

1.2.3.4不同濕度對孢子萌發的影響

將孢子懸浮液均勻涂抹于載玻片上,在室溫下自然干燥,用小容器調節法,以硫酸控制相對濕度,濕度設置為70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99.5%,以100%飽和濕度為對照,共9個處理,20℃下培養。其他同上。

1.2.3.5不同營養條件對孢子萌發的影響

分別以尿素、馬糞浸漬液、土壤浸漬液、葡萄糖、柴胡根浸液、柴胡葉浸液1∶5、1∶10、1∶20稀釋成孢子懸浮液,20℃下懸滴培養[16],其他同上。

2 結果與分析

2.1 癥狀

病原菌主要危害葉片、莖稈。葉部產生直徑為1～2.5 mm的近圓形、橢圓形、半圓形小病斑,邊緣紫褐色,稍隆起,中部黃褐色、灰褐色，后變灰白色。葉片兩面的病斑上均可產生黑色小顆粒,即病菌的分生孢子器。有些病斑自葉尖向下擴展呈“V”字形,有些沿葉緣發生,造成中脈一側枯死。發病嚴重時,病斑相互匯合,引起葉片枯死。

2.2 病原

病原菌在PDA培養基上菌落灰白色至肉粉色,分生孢子器埋生在菌絲中,孢子量少,菌絲呈紫紅色,菌絲壁較厚,產紫色色素,生長速度0.73 mm/d(圖1a);在OA培養上的培養性狀同PDA培養基,生長速度:0.99 mm/d,有少量分生孢子器,似乎孢子還未成熟(圖1b);在MEA培養基上,菌落黑灰色,有大量的分生孢子器,孢子角肉粉色,生長速度0.44 mm/d(圖1c)。

圖1 柴胡斑枯病菌菌落及微觀形態Fig.1 Colonies and morphology of Septoria bupleuricola

挑取組織上病原并對分生孢子器切片觀察,此菌分生孢子器近球形或球形,黑褐色,器壁由1～2層細胞構成,高66.4～90.2 μm(平均77.5 μm),直徑57.3～90.0 μm(平均70.5 μm)(圖1d),外壁細胞黑褐色,內層淡褐色至無色,具圓形孔口,大小(10～30.2)μm×(10～31.4)μm,平均18 μm×20.25 μm,孔口細胞壁明顯增厚;分生孢子梗產生于內壁細胞,無色,大小為(1.5～5.0)μm×(1.0～3.0)μm,平均2.7 μm×2.8 μm(圖1e)。分生孢子針形、基部較圓,頂部較細、無色,有些稍彎曲,具1～3隔膜,大小(13.0～26.0)μm×(1.5～3.0)μm,平均19.0 μm×2.0 μm(圖1f)。此菌分生孢子兩端和中間細胞均可萌發長出無色芽管。經分離培養和從組織上挑取病原鏡檢,內有順序排列的小油珠。該菌引起的病害在甘肅省干旱地區種植的柴胡上發生普遍,且較嚴重。

依據形態和培養特性,根據參考資料,將柴胡斑枯病菌鑒定為真菌界無性態真菌柴胡殼針孢SeptariabupleuricolaSacc.。

2.3 柴胡枯斑病病原系統發育分析

通過對ITS、LSU、RBP2和β-tubline片段的擴增和測序,得到長度分別為516、894、1 166和423 bp的序列(登錄號分別為:KC874675,KY798144,KY798146和KY798145)。用BLASTn在GenBank中搜索并下載同源序列,通過多基因片段拼接并構建系統發育樹發現,菌株TCM-5與寄生于柴胡B.chinense的柴胡殼針孢S.bupleuricola(菌株:CBS128601,CBS128603)聚類在同一分支上(圖2),同時該菌株分生孢子1～3個隔膜,孢子大小為(15.3～38.8)μm×(0.9～1.2)μm,與柴胡殼針孢S.bupleuricola相似,依據多基因序列片段和形態鑒定結果,將柴胡斑枯病菌TCM-5鑒定為柴胡殼針孢S.bupleuricola。

圖2 柴胡斑枯病菌多基因序列分析Fig.2 Phylogenetic tree of 8 strains based on a combined dataset of ITS, LSU, RPB2 and β-tubulin sequences

2.4 病原菌生物學特性

2.4.1 溫度對菌絲生長,產孢和孢子萌發的影響

該菌在0～35℃范圍內均能生長,適宜溫度為20～25℃,但生長緩慢,5～25℃病菌的生長量隨溫度的升高而緩慢升高,低于5℃或高于30℃生長速率急劇下降,在20℃下,生長速度最快，為0.6 mm/d,20 d時菌落直徑11.8 mm；而35℃時急劇下降,20 d菌落直徑僅為1.8 mm。這表明該菌生長極其緩慢,并且高溫抑制該菌正常生長發育(表1)。

該菌產孢溫度范圍較寬,在5～35℃均能產孢,適宜溫度為10～15℃,產孢量分別為18.1×104個/ cm2和18.5×104個/cm2,與其他溫度的產孢量存在極顯著的差異。低于5℃不產孢,高于30℃產孢量急劇下降(表1)。

表1不同溫度對柴胡殼針孢菌絲生長、產孢量和孢子萌發的影響(20d)1)

Table1Colonydiameters,sporeproductionandgerminationratesofSeptoriabupleuricolaatdifferenttemperatures(20d)

溫度/℃Temperature菌落直徑/mmDiameterofcolony4d8d12d16d20d產孢量/×104·(cm2)-1Yieldofspores孢子萌發率/%Germinationrate8h12h24h36h48h60h72h00．00．00．00．5(1．3±1．2)e(0．0±0．0)c0．00．00．00．00．20．7(1．2±0．8)e50．00．00．50．8(2．2±1．0)cde(8．7±2．0)b0．00．30．81．82．54．2(5．7±1．0)e100．00．21．21．5(3．5±2．2)cd(18．1±1．2)a0．00．72．03．74．56．7(8．8±1．2)cd150．01．01．52．8(4．0±2．1)bc(18．5±3．0)a0．87．812．319．731．534．0(36．5±2．0)a200．01．56．08．8(11．8±3．2)a(12．0±2．4)b0．76．711．817．825．830．8(36．2±2．0)a250．01．74．88．2(11．3±2．0)a(4．0±1．2)c0．03．29．313．716．324．8(31．2±3．2)a300．00．31．84．5(5．7±1．0)b(1．4±1．0)c0．01．86．77．88．313．8(19．3±1．0)b350．000．51．0(1．8±1．0)de(1．4±1．0)c0．000．74．75．56．5(12．8±2．0)c

1) 表中數據為平均值±SD,同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下同。

Data are mean±SD.Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level by LSD. The same below.

分生孢子在0～35℃均可萌發,15℃為適宜萌發溫度,30℃時萌發率急劇下降,35℃不萌發。該菌孢子萌發速度很緩慢,最適溫度下8 h萌發率0.8%,72 h最高萌發率達36.5%(表1)。由此可見,病菌菌絲生長和孢子萌發速度均緩慢;孢子萌發和孢子形成的適溫均為15℃,而菌絲生長的適溫為(20～25℃),由此可見,柴胡殼針孢孢子形成、萌發和菌絲生長緩慢,但是適應溫度范圍較廣,所以在甘肅省發生面積和地域范圍較廣。

2.4.2 菌絲生長、產孢及孢子萌發的光照條件

從表2可以看出,菌絲在連續光照條件下生長較好,20 d菌落直徑可達到11.0 mm,產孢量最大,達到5.8×104個/cm2,顯著高于其他處理;同樣分生孢子在連續光照條件下,72 h萌發率最高達34.3%。而在光暗交替和連續黑暗條件下菌落生長、產孢量和孢子萌發率無顯著差異,但均低于連續光照。表明連續光照有利于菌絲生長、孢子萌發和病菌產孢。

表2不同光照對柴胡殼針孢菌絲生長、產孢量(20d)和孢子萌發的影響

Table2Colonydiameters,sporeproduction(20d)andgerminationratesofSeptoriabupleuricolaatdifferentilluminationconditions

處理Illuminatingcondition菌落直徑/mmDiameterofcolony8d12d16d20d產孢量/×104個·(cm2)-1Yieldofspores孢子萌發率/%Germinationrate8h12h24h36h48h60h72h連續光照Continuousillumination1．24．57．2(11．0±3．2)a(5．8±1．5)a0．33．39．315．522．028．3(34．3±2．0)a光暗交替12hillumination/12hdarkness1．54．77．3(9．3±1．8)b(3．1±1．8)b0．24．811．814．217．023．7(31．5±3．2)b連續黑暗Continuousdarkness0．73．87．3(9．8±1．2)b(3．7±2．0)a0．04．210．312．013．821．0(28．7±2．3)b

2.4.3 菌絲生長、產孢及孢子萌發的pH

表3結果表明:病菌生長適宜的pH范圍較寬,在pH 4.0～10.0范圍內均能生長,pH5.0時菌落生長最快,20 d可達到13.8 mm;產孢要求的pH為5.0～9.0。其中以pH 5.5產孢量最大,達到6.7×104個/cm2,pH低于5.0和高于9.0均不產孢。

表4結果表明:分生孢子在pH 4.51～9.19間均可萌發,以pH 6.49最好,72 h孢子萌發率達10.33%,pH高于7.00孢子萌發率逐漸下降。孢子的形成、萌發及菌絲的生長均以偏酸性條件為好。

表3不同pH條件對柴胡殼針孢菌絲生長和產孢量(20d)的影響

Table3Colonydiameters,sporeproduction(20d)ofSeptoriabupleuricolaatdifferentpHdegrees

pH菌落直徑/mm Diameterofcolony8d12d16d20d產孢量/×104個·(cm2)-1Yieldofspores4．01．34．57．5(8．5±0．8)c (0．0±0．0)c4．52．36．811．8(13．2±1．3)a(0．0±0．0)c5．04．37．812．0(13．8±1．2)a(4．0±0．7)bc5．50．53．06．2(11．5±1．3)b(6．7±0．5)a6．01．85．28．7(11．3±1．8)b(5．2±1．2)b6．51．24．59．0(11．7±2．2)b(5．2±3．7)b7．01．04．77．5(11．0±2．2)b(4．0±3．1)bc7．51．74．87．8(10．8±2．6)bc(3．9±0．2)bc8．02．24．57．7(9．8±2．1)bc(4．5±2．2)bc8．52．35．38．5(10．8±1．6)bc(1．7±1．2)c9．01．03．86．0(8．3±3．1)c(1．6±0．2)c9．51．03．06．2(8．7±1．3)c(0．0±0．0)c10．01．24．37．2(8．3±1．5)c(0．0±0．0)c

表4不同pH條件下孢子萌發率

Table4GerminationratesofSeptoriabupleuricolaatdifferentpHdegrees

pH孢子萌發率/% Germinationrate8h12h24h36h48h60h72h4．510．01．22．74．26．27．3(8．3±1．2)bc5．580．52．24．76．38．08．7(9．7±3．2)ab6．490．31．74．35．56．88．8(10．3±3．2)a7．000．31．53．85．26．36．7(7．3±2．6)cd7．410．01．03．54．24．55．2(5．7±0．8)d8．390．00．82．02．32．53．2(3．8±1．7)e9．190．00．71．71．82．22．8(3．5±0．3)e

2.4.4 孢子萌發的濕度條件

表5結果表明:分生孢子在相對濕度75%～99.5%和水滴中均可萌發,以對照水滴中萌發最好,達到23.0%,與其他處理均有極顯著差異,其次為100%的相對濕度,萌發率13.7%,而RH在99.5%以下,孢子萌發率逐漸下降,70%時不萌發。

表5不同濕度對柴胡殼針孢孢子萌發率的影響

Table5SporegerminationratesofSeptoriabupleuricolaatdifferentrelativehumidities

相對濕度/%Relativehumidity孢子萌發率/% Germinationrate8h12h24h36h48h60h72h水滴Water0．0．20．51．711．819．321．0(23．0±3．3)a1000．00．00．75．38．710．3(13．7±2．6)b99．50．00．00．72．55．36．3(7．7±1．6)b980．00．00．31．52．84．3(5．8±1．4)b950．00．00．20．51．21．8(3．2±2．1)c900．00．00．00．30．81．5(2．3±1．2)cd850．00．00．00．20．30．8(1．7±1．6)cd800．00．00．00．00．20．7(0．8±0．5)d750．00．00．00．00．00．3(0．7±0．5)d700．00．00．00．00．00．0(0．0±0．0)d

2.4.5 孢子萌發的營養條件

圖3表明,分生孢子在柴胡葉片浸漬液中萌發最好,萌發率達57.0%～60.33%,高出對照40.66百分點,其次是柴胡根浸液和土壤浸漬液,分別為49.3%～60.5%及15.3%～26.5%,均高于清水對照的萌發率。

圖3 不同營養液中柴胡斑枯病菌孢子萌發率(72 h)Fig.3 Spore germination rates (72 h) of Septoria bupleuricola in different nutrition media

圖4表明,柴胡斑枯病菌分生孢子萌發時速度很慢,即使在適宜的營養液中,前期12 h萌發率在10%左右, 24～48 h間增長至54%,說明24～48 h是孢子萌發的最快時期,這與溫度、濕度等試驗中的結果一致。

3 討論

3.1 病原

生于柴胡葉上的殼針孢屬真菌記載有4種:(1)S.amphigenaMiyake,其分生孢子器120～150 μm,分生孢子3個隔膜,大小(18～22)μm×(1.5～2)μm; (2)S.buplenricolaSacc.,其分生孢子大小(24～30)μm×2 μm;(3)S.buplenrina,其分生孢子3個隔膜,大小(32～43)μm×2.2 μm;(4)S.buplenri-taleatiDiet.,其分生孢子3個隔膜,大小(30～40)μm×2 μm[9]。白金鎧認為這4種菌在形態上均與S.buplenri相似,其分生孢子器大小(55～135)μm×(50～110)μm,分生孢子1～4個隔膜,多為2～3個隔膜,分生孢子器球形,分生孢子隔膜和大小也均相近,均應視為其異名。甘肅省柴胡斑枯病的病原通過形態學和分子生物學鑒定,確定為S.bupleuricolaSacc.。

圖4 不同營養液中柴胡斑枯病菌孢子萌發率Fig.4 Spore germination rate of Septoria bupleuricola in different nutrition media

3.2 病原菌的生物學特性

病原菌的培養特性和生物學特性與病害的發生發展密切相關。殼針孢屬Septoria真菌是在全球分布最廣泛、最常見的一類病原菌,寄主范圍廣泛,可寄生于很多植物的葉片和果實上,引起葉斑或果斑癥狀[20]。該屬真菌普遍生長緩慢,菌絲生長、產孢和孢子萌發均需要較低的溫度和持續的露水。如當歸褐斑病菌Septoriasp.分生孢子萌發的適溫為20℃,相對濕度要求在75%以上[21]。本研究對柴胡斑枯病菌生物學特性的測定結果表明,該菌菌絲生長、產孢和孢子萌發的最適溫度分別為20～25℃、15、10～15℃,孢子萌發相對濕度要求在75%以上,菌絲生長、孢子萌發和產孢的適宜pH分別為5.0、6.49和5.5,因此在低溫,高濕和中性偏酸環境下該病易于侵染和發生。甘肅省定西地區柴胡主產區隴西縣、靈臺縣、渭源縣、漳縣及安定區等地屬高寒陰濕地區,氣溫較低,陰濕多露,適于孢子的萌發和侵染,因此病害發生重。

3.3 防治建議

在栽培過程中,建議多采用玉米-柴胡和小麥-柴胡套種模式, 不僅利用前作物的遮陰保濕作用代替地面蓋草,節約了蓋草成本,有利于柴胡出苗、出壯苗,而且還可以減少病蟲害的發生[22]。依據課題組對當歸褐斑病防治的研究[23]以及國內對龍膽草斑枯病的藥劑防治研究結果[24],建議在柴胡斑枯病發病初期噴施50%多菌靈可濕性粉劑600倍液、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑700倍液、10%苯醚甲環唑水分散顆粒劑1 800倍液、78%波·錳鋅可濕性粉劑600倍液及70%丙森鋅可濕性粉劑600倍液。7～10 d噴施1次,連續噴施3次。并且在柴胡收獲后,徹底清除病殘組織,集中燒毀或漚肥,減少越冬菌源,可減輕來年病害的發生。

[1] 周榮漢. 中藥資源學[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社, 1993: 384-391.

[2] 國家藥典編委會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京: 化學工業出版社, 2005: 198.

[3] 王玉慶, 牛顏冰, 秦雪梅, 等.野生柴胡資源調查[J].山西農業大學學報, 2007, 27(1): 103-107.

[4] 馮亦平, 牛顏冰, 王玉慶, 等.柴胡播種技術研究[J].山西農業大學學報(自然科學版), 2006, 26(5): 23-25.

[5] 李曉偉, 王玉慶, 杜國軍, 等.藥用柴胡資源調查及市場現狀分析[C]∥海峽兩岸暨CSNR全國第10屆中藥及天然藥物資源學術研討會論文集.蘭州，2012: 159-165.

[6] 張世祖, 馬慶江.政策性金融支持甘肅中藥材產業發展情況的調查與思考[J].甘肅金融, 2015(2): 58-60.

[7] 戴芳瀾.中國真菌總匯[M].北京: 科學出版社, 1979.

[8] 韓金聲.中國藥用植物病害[M].長春:吉林科學技術出版社,1990:605.

[9] 白金鎧.中國真菌志(第十七卷)球殼孢屬、殼針孢屬[M].北京: 科學出版社, 2003: 313.

[10] 莊劍云.中國真菌志:銹菌目(二)[M].北京:科學出版社,2001.

[11] 李勇, 劉時輪, 楊成民,等. 北京地區柴胡根腐病的病原菌鑒定[J].植物病理學報, 2009, 39(3): 314-317.

[12] 陳秀蓉.甘肅省藥用植物病害種類及其防治[M]. 北京: 科學出版社, 2015:23-25.

[13] Zhang Z, Wei J H, Yang C M, et al. First report ofAlternarialeaf blight onBupleurumchinensecaused byAlternariaalternatain China [J]. Plant Disease, 2010, 94(7): 918.

[14] 方中達.植病研究方法[M].北京: 農業出版社, 1979.

[15] White T J, Bruns T, Lee S B, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]∥Innis M A, Gelfand D H, Sninsky J J, et al. PCR protocols: a guide to methods and applications. New York: Academic Press,1990: 315-322.

[16] Liu Yajuan, Whelen S, Hall B D.Phylogenetic relationships among ascomycetes: evidence from an RNA polymerase Ⅱ subunit [J].Molecular Biology and Evolution,1999,16(12):1799-1808.

[17] Verkley G J, Quaedvlieg W, Shin H D, et al. A new approach to species delimitation in Emporia[J]. Studies in Mycology, 2013,75(1):213-305.

[18] Stukenbrock E H, Quaedvlieg W, Javan-Nikhah M, et al.ZymoseptoriaardabiliaeandZ.pseudotritici, two progenitor species of theSeptoriatriticileaf blotch fungusZ.tritici(synonym:Mycosphaerellagraminicola)[J]. Mycologia, 2012, 104(6): 1397-1407.

[19] Hall T A.BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT [J].Nucleic Acids Symposium Series, 1999(41): 95-98.

[20] Verkley G J M,Starink-Willemse M,van Iperen A,et al.Phylogenetic analyses ofSeptoriaspecies based on the ITS and LSU-D2 regions of nuclear ribosomal DNA[J].Mycologia,2004,96(3):558-571.

[21] 王艷,陳秀蓉,王引權,等.甘肅省當歸褐斑病菌Septoriasp.生物學特性及其營養利用研究[J].中藥材,2009,32(4):479-482.

[22] 王玉慶,楊忠義, 楊靜, 等. 黃土高原半干旱區柴胡種植模式[J]. 應用生態學報, 2011, 22(3):825-828.

[23] 王艷, 陳秀蓉,王惠珍,等. 六種殺菌劑對當歸褐斑病菌室內毒力的測定[J].甘肅中醫學院學報,2008, 25(5):27-29.

[24] 孫立晨, 高郁芳, 劉志剛,等. 防治龍膽草斑枯病藥劑篩選試驗[J]. 植物保護, 2006, 32(6):154-156.

(責任編輯： 田 喆)

PathogenidentificationandbiologicalcharacteristicsofleafspotonBupleurumchinense

Wang Yan, Jin Ling, Zeng Cuiyun, Luo Jun, Zhu Tiantian

(GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China)

During disease surveys on medicinal plants in Gansu Province in 2011-2014, we found that leaf spot onBupleurumchinenseDC.was a serious disease with 13%-21% disease incidence and 1-2 level of disease severity. Morphological and molecular methods were combined to identify and test the biological characteristics of the pathogen. The pycnidia of the pathogen was spherical or sub-spherical, 66.4-90.2 μm (mean: 77.5 μm)in height, 57.3-90.0 μm (mean: 70.5 μm) in diameter, conidia hyaline, needle, with 1-3 septates of (13.0-26.0)μm×(1.5-3.0)μm (mean: 19.0 μm×2.0 μm) in size. Multi-locus phylogenic analysis of the five loci: ITS, LSU, RBP2 andβ-tubulin showed that the pathogen wasSeptoriabupleuricolaSacc. The temperature ranges of hypha growth, spore germination and production were 0-35, 0-35 and 5-35℃, respectively. The optimum temperatures were 20-25, 15 and 10-15℃, correspondingly. Continuous illumination facilitates hyphal growth, spore production and germination. The pH ranges of the hypha growth, spore germination and production were 4.0-10.0, 4.51-9.19 and 5.0-9.0, with the optimum values of 5.0, 6.49 and 5.5, respectively. The relative humidity for spore germination was above 75%. Spores germinated well in water. Root and leaf extracts stimulated spore germination. The optimum temperature for mycelium growth and spore germination of the pathogen was low, indicating that the disease might worsen under low-temperature, dewing and continuous rainy weather.

Bupleurumchinenseleaf-spot; morphology; multi-locus phylogeny; pathogen identification; biological characteristic

2017-01- 08

2017-03-03

國家自然科學基金(31460013);甘肅省科技計劃項目(1508RJ2A011);甘肅省科技計劃基礎研究創新群體(1606RJIA323);中央財政引導地方科技創新平臺項目(2016-A-02)

聯系方式 E-mail:gswangyan101@163.com

S 435.67

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.012