滇重樓預處理對膿毒癥大鼠的腸道功能保護及小腸HMGB1表達的影響

熊偉+陳思如+修光輝+凌斌+孫潔+劉萍

摘要：目的構建脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導膿毒癥（sepsis）大鼠早期腸損傷模型，給予不同濃度滇重樓（Rhizoma Paridis of yunnan）灌胃預處理，探討滇重樓對膿毒癥大鼠的腸道功能保護及小腸高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）表達的影響。方法清潔級成年SD大鼠雌性80只，隨機分為5組，16只/組，對照組、模型組、低劑量組（20mg/kg.po）、中等劑量組（40mg/kg.po）、高劑量組（80mg/kg.po）。給予滇重樓預處理后，構建膿毒癥大鼠模型（LPS 1mg/kg.iv），于24h取材，檢測血中白細胞數（WBC）、谷丙轉氨酶（ALT）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、肌酐（Cre）、乳酸（Lac）的含量，行小腸病理檢查并組織學評分，采用ELISA法檢測血漿中二胺氧化酶（DAO）和D乳酸（D-Lac）的含量，分別采用WesternBlot和Q-PCR檢測小腸中HMGB1的蛋白及mRNA表達水平。結果模型組大鼠與對照組比較全血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高，WBC含量下降，有統計學意義（P<0.05）；模型組與對照組比較大鼠存活率下降，病理組織學評分>Ⅲ級百分比升高，有統計學意義（P<0.05）；不同濃度滇重樓預處理均能改善膿毒癥大鼠的實驗室指標、存活率及病理組織學評分，但治療組與模型組比較ALT及高劑量組Cre差異無統計學意義（P>0.05）。模型組血漿中DAO和D-Lac含量高于對照組，而滇重樓治療組低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組大鼠小腸HMGB1的蛋白及mRNA表達水平高于對照組，而滇重樓治療組低于模型組（P<0.05）。結論滇重樓預處理可能通過抑制HMGB1表達參與抗炎反應，從而改善小腸黏膜屏障通透性，發揮腸道保護功能，同時提高膿毒癥大鼠的生存率，優化預后。

關鍵詞：膿毒癥；滇重樓；腸道功能保護；高遷移率族蛋白B1

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）11-0071-04膿毒癥（sepsis）是重癥醫學科危重患者常見死因之一，患病率約為人口3‰，病死率高達20.3%～29.9%[1]，是機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙[2]，也是嚴重創傷、休克、感染、外科手術等常見并發癥。目前，膿毒癥的發病機制尚不完全明確，而腸道細菌及內毒素移位導致的腸黏膜屏障功能障礙是其主要機制之一，也是膿毒癥發生的始動環節，可誘發失控性全身炎癥反應綜合征（systematic inflammatory response syndrome，SIRS）致多器官功能障礙綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），常表現為腸道功能紊亂發生最早及恢復最遲。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種高度保守的非組DNA結合蛋白，可誘導RAGE、TLR2/4、NF-κB等炎癥因子釋放導致多器官靶細胞損傷，作為一種晚期炎癥因子在膿毒癥的發生發展中起重要作用[3-5]。

據報道，滇重樓多種成分具有抗炎作用，臨床可用于器官保護、抗病原微生物、抗蛇蟲毒及治療免疫系統和婦產科疾病[6]。筆者前期研究，利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）15mg/kg腹腔注構建大鼠腸黏膜功能障礙模型，滇重樓連續灌胃提示其腸黏膜抗炎保護作用。但結合臨床實踐經驗，膿毒癥炎癥因子瀑布樣級聯釋放常使疾病迅速向MODS難逆轉性轉變，如何在SIRS早期通過抑制炎癥因子釋放成為干預疾病轉歸的重點。本課題擬通過LPS 1mg/kg股靜脈注射構建膿毒癥大鼠早期腸損傷模型，探討滇重樓預處理對膿毒癥大鼠的腸道功能保護及小腸HMGB1表達的影響。

1材料與方法

1.1材料清潔級健康成年SD大鼠雌性80只，體重（200±10）g，由解放軍昆明總醫院科研實驗中心提供（實驗動物質量合格證號：SYXK（滇）2016-2017）。滇重樓由昆明醫科大學第四附屬醫院藥劑科提供。脂多糖購于美國Sigma公司；血漿二胺氧化酶（DAO）和D乳酸（D-Lac）ELISA試劑盒購于武漢華美公司；HMGB1一抗、二抗購于abmart公司；Trizol Reagent 試劑盒購于Lifetech公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購于Fermentas公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組實驗采用成組設計，清潔級健康SD大鼠雌性80只，隨機分為5組，對照組、模型組、低劑量組、中等劑量組、高劑量組，每組16只。將滇重樓顆粒用生理鹽水制成混懸液灌胃預處理，劑量按照成人劑量的5倍、10倍、20倍，分別對應低劑量組（20 mg/kg）、中等劑量組（40 mg/kg）、高劑量組（80 mg/kg），對照組及模型組給予相同劑量生理鹽水。除對照組經股靜脈予以相同劑量生理鹽水外，其余組經股靜脈予以LPS 1 mg/kg.iv。灌胃前禁食禁飲2 h，灌胃后正常飲食，密切觀察大鼠排便進食、呼吸心跳、精神狀態等變化，于24 h取材分別進行檢測。

1.2.2實驗室指標檢測腹腔注射水合氯醛0.4 g/kg麻醉大鼠，迅速開腹經腹主動脈采集動脈血，分別檢測各組動物白細胞數（WBC）、谷丙轉氨酶（ALT）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、肌酐（Cre）、乳酸（Lac）觀察模型成立及臟器功能變化情況。

1.2.3存活率及病理組織學評分觀察24 h內膿毒癥大鼠存活率。分別取各組大鼠小腸用10%多聚甲醛固定24 h，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、常規切片和蘇木素-伊紅染色后，封片鏡檢，并對小腸切片病理組織學評分[7]：0級，黏膜無明顯炎癥；I級，黏膜有明顯水腫，黏膜下及肌層內輕度白細胞浸潤；II級，黏膜明顯水腫，黏膜下及肌層內白細胞浸潤增多；III級，黏膜部分缺失，腺體部分不完整，白細胞聚集；IV級，黏膜廣泛破壞，腺體多數不完整，潰瘍形成，肉芽組織形成，組織結構明顯破壞。endprint

1.2.4ELISA法檢測DAO和D-Lac水平分別取各組大鼠全血離心制成血漿，按每孔100ul分別加標準品或待測樣本，37℃溫育，依次加生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液、底物溶液、終止溶液，終止反應后5min內用酶標儀在450nm波長依次測量各孔OD值，分別對照DAO和D-Lac標準品進行統計分析。

1.2.5WesternBlot法檢測小腸HMGB1水平分別取小腸標本制成檢測標本，在樣品中等體積2×上樣緩沖液，按每孔100 ug蛋白上樣液。配10% SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，轉印，恒流轉膜，5% 脫脂牛奶封閉，室溫，搖床上搖2 h，加β-actin一抗，1：1000，4℃，過夜；TBST漂洗，加入HRP標記通用型二抗（goat來源），孵育1 h，TBST漂洗，成像。掃描條帶，并用Image J進行分析。

1.2.6Q-PCR檢測小腸mRNA水平采用Trizol法分別提取小腸組織的總RNA，逆轉錄獲得cDNA，Q-PCR儀擴增（按說明書操作）。大鼠HMGB1上游引物5-TTCTTCTTGTTCTGTTCTGAG-3，下游引物5-CTTCGCAACATCACCAAT-3，PCR產物大小219 bp；內參照β-actin上游引物5-CGAGAAGATGACCCAGAT-3，下游引物5-GATAGCACAGCCTGGATA-3。軟件自行得出△Ct、△△Ct、2-△△Ct值，由溶解曲線判斷擴增產物的特異性。

1.3統計學處理

使用SPSS 21.0統計軟件進行統計學處理。全部數據均用均數±標準差（x±s）表示，P<0.05有統計學意義；P>0.05無統計學意義。各實驗組的組間及組內均采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）對資料進行統計處理。率的比較用完全隨機設計資料χ2檢驗，P<0.05提示兩個率差異有統計學意義，P>0.05提示兩個率之間差異無統計學意義。

2結果

2.1生化指標檢測結果模型組大鼠與對照組比較全血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高，WBC含量下降，差異均有統計學意義（P<0.05）；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較全血中CK-MB、Lac含量下降，WBC含量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；但治療組與模型組比較ALT及高劑量組Cre差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2膿毒癥大鼠存活率及病理組織學評分結果模型組與對照組比較大鼠存活率下降，病理組織學評分>Ⅲ級百分比升高，差異均有統計學意義（P<0.05），且模型組大鼠死亡率高達62.5%；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較大鼠存活率升高，病理組織學評分>Ⅲ級百分比下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2，圖1。

2.3滇重樓對膿毒癥大鼠腸道功能保護作用模型組與對照組比較血漿中DAO和D-Lac含量升高，差異有統計學意義（P<0.05）；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較血漿中DAO和D-Lac含量下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3，圖2。

2.4滇重樓對膿毒癥大鼠小腸HMGB1的表達影響模型組與對照組比較小腸中HMGB1蛋白和mRNA含量升高，差異有統計學意義（P<0.05）；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較小腸中HMGB1蛋白和mRNA含量下降，差異有統計學意義（P<0.05），其中中等劑量組下降最明顯。見表4，圖3～4。

3討論

滇重樓為云南道地藥材，資源豐富，品質優良，具有極高的藥用價值，其起效方式表現在免疫調節、抗氧化作用以及對炎癥細胞和因子、下丘腦-垂體-腎上腺軸、細胞凋亡、凝血/纖溶系統的影響[6]，呈現出多成分、多靶點、多途徑的起效方式，對于致病機制復雜的膿毒癥可以起到多方位作用。周滿紅等[7]利用重樓總皂苷（RPTS）干預膿毒癥大鼠肺損傷可使血中早期炎癥因子TNF-α和IL-1顯著降低。黃彥峰等[8]報道證實重樓水提液可調節小腸運動從而治療腸道功能紊亂，其機理可能與M膽堿能受體、腎上腺素能系統有關。前期實驗也發現，滇重樓連續灌胃可明顯改善膿毒癥大鼠腹瀉、精神萎靡、運動遲緩等癥狀，但是，膿毒癥炎癥因子瀑布樣級聯釋放常使疾病迅速向MODS難逆轉性轉變，如何在SIRS早期通過抑制炎癥因子釋放成為干預疾病轉歸的重點。

Tropskaya NS和Zhang Y等[9-11]研究發現滇重樓等中藥可改善重癥患者APACHE-Ⅱ評分、腸鳴音評分和SIRS評分，緩解腹脹、血白細胞計數降低，減少與膿毒癥相關的胃腸功能障礙，其機制可能與營養支持、抗炎反應、調節腸蠕動、抗膽堿能通路等有關。本實驗發現中，模型組與對照組相比大鼠血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高，WBC含量下降，差異均有統計學意義（P<0.05），提示模型組大鼠全身多個系統（肝、心、腎、循環及免疫等）均表現出功能障礙，且死亡率>60%，符合膿毒癥模型指標。但治療組ALT和Cre與模型組差異無統計學意義（P>0.05），可能與滇重樓的肝腎毒性有關。經滇重樓預處理的治療組與模型組比較，血漿中DAO和D-Lac降低，小腸病理組織學評分>Ⅲ級百分比下降，差異均有統計學意義（P<0.05），表明滇重樓可改善腸黏膜通透性，早期預防腸內細菌移位及內毒素入血，阻斷膿毒癥進展，從而起到腸道保護作用。

HMGB1通過壞死細胞破壞被動釋放或主動活化炎癥細胞，而介導早期和晚期炎癥反應及適應性免疫應答，其含量與疾病的嚴重程度呈正相關[12-14]。在本實驗中，模型組小腸中HMGB1蛋白和mRNA表達水平高于對照組，而滇重樓治療組低于模型組（P<0.05），其中中等劑量組下降最明顯，說明滇重樓對晚期炎癥因子HMGB1的分泌有抑制作用。綜上所述，滇重樓預處理可能通過抑制HMGB1表達參與抗炎反應，從而改善小腸黏膜屏障通透性，發揮腸道保護功能，同時提高膿毒癥大鼠的生存率，優化預后。endprint