應用遺傳算法和神經網絡優化多殺菌素發酵培養基

張峰+吳柳娟+李躺+王燦+胡益波+丁學知+夏立秋

摘 要 通過優化刺糖多孢菌發酵合成多殺菌素培養基成分，改善培養條件，從而提高多殺菌素產量.在單因素以及Plackett-Burman試驗設計的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計方法對發酵培養基組分中的玉米漿、可溶性淀粉、丙酸鈉進行研究，運用遺傳算法優化的BP神經網絡建立多殺菌素產量與培養基組分濃度之間的預測模型，采用循環算法對此模型進行尋優，得到三種組分的最佳配比為：玉米漿7 g/L、可溶性淀粉16 g/L、丙酸鈉2 g/L，多殺菌素產量達到（550.22±3.84）mg/L，采用上述方法優化后的培養基使得多殺菌素產量比原始培養基產量（225 mg/L）提高145%.本研究結果可為培養基優化提供一種有效的建模方法.

關鍵詞 刺糖多孢菌；多殺菌素；發酵培養基優化；神經網絡；遺傳算法

中圖分類號 S4823；TQ927 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2537（2017）05-0036-08

Optimization of the Spinosad Fermentation Medium by Applying Genetic Algorithm and Neural Network

ZHANG Feng， WU Liu-juan， LI Tang， WANG Can， HU Yi-bo， DING Xue-zhi， XIA Li-qiu*

（State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology， Key Laboratory of Developmental Biology of

Freshwater Fishes， College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstract In this work， we report an approach to improve spinosad production by optimizing the fermentation medium components. Corn steep liquor， soluble starch and sodium propionate in the fermentation medium were investigated by Box-Behnken design （BBD）， which was based on single factor and the Plackett-Burman design. Moreover， a prediction model of the spinosad yield as a function of the medium component concentration has been established by using the artificial neural network （ANN） optimized by genetic algorithm （GA）. Using ANN optimized by GA as the objective function， we employed the circulatory algorithm to optimize the medium components and the optimal ratio of the three components as follows： with corn steep liquor 7 g / L， soluble starch 16 g/L， and sodium propionate 2 g/L， the final yield of spinosad reached （550.22±3.84） mg/L， which was 145% higher than the original fermentatiom medium（225 mg/L）obtained when cultured on the optimized medium. Our results from this study can provide an effective modeling method for medium optimization.

Key words saccharopolyspora spinosa； spinosad； optimization of fermentation medium； neural network； genetic algorithm

多殺菌素又名刺糖菌素，是由土壤放線菌刺糖多孢菌 （Saccharopolyspora spinosa）經有氧發酵產生的具有大環內酯結構的次級代謝產物[1].因其具有廣譜殺滅害蟲作用，對人、非靶標動物和環境安全，可生物降解等優點[2]，被國際上認為是一種具有發展前景的綠色殺蟲防護劑.

自2005年，美國環保局（ United States Environmental Protection Agency）批準將多殺菌素作為儲糧防護劑以來，已在有機作物上應用[3-4]，但多殺菌素工業發酵產量很低[5]，如何提高發酵產量受到國內外研究者的高度重視.已有研究者通過遺傳改造的方法，使多殺菌素產量得到不同幅度的提高[6-9].刺糖多孢菌發酵多殺菌素，不僅與其遺傳基礎有關，而且與其培養條件也密切相關[10].優化發酵培養基成分，是提高多殺菌素產量的一個有效技術途徑.但多殺菌素發酵培養基組分復雜，組分間往往存在較強的交互作用，培養基組分和發酵目的產物間是一種非線性關系；由于神經網絡能以任意精度逼近非線性函數，而遺傳算法既可以避免陷入局部最小，又可以加快收斂速度，所以將神經網絡和遺傳算法結合，非常適合非線性模型的建立.研究表明，利用BP神經網絡結合遺傳算法進行微生物發酵條件優化，能促進發酵目的產物的產量得到不同程度的提高[11-14].endprint

本文通過單因素實驗結果及文獻研究結果[15-17]，篩選出幾種促進作用的因子，進行Plackett-Burman試驗設計，篩選出對發酵多殺菌素具有顯著影響的因子進行下一步的Box-Behnken響應面優化.基于Box-Behnken試驗設計的結果構建利用遺傳算法優化的BP神經網絡模型，進一步尋找多殺菌素發酵最優培養基配方.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）菌株，本實驗室選育保藏.初始發酵培養基培養10 d，多殺菌素產量為225 mg/L.

1.1.2 試劑 TSB（Tryptic Soy Broth）（海博生物技術有限公司，AR）；葡萄糖（上海山浦化工有限公司，AR）；酵母粉（安琪酵母股份有限公司，BR）；七水合硫酸鎂（天津化學試劑三廠，AR）；棉籽粉（北京中棉紫光生物科技公司，工業級）；豆餅粉（濟寧雙華工貿有限公司，工業級）；可溶性淀粉（國藥集團化學試劑有限公司，AR）；碳酸鈣（國藥集團化學試劑有限公司，AR）；油酸甲酯（上海阿拉丁試劑有限公司，CP）；油酸丁酯（上海阿拉丁試劑有限公司，CP）；丙酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，CP）；氯化鋇（國藥集團化學試劑有限公司，AR）；玉米漿（上海源葉生物科技有限公司，AR 45%）.

1.1.3 培養基及溶液 種子培養基（g/L）：TSB（Tryptic Soy Broth） 45.0；葡萄糖10.0；酵母粉9.0；七水合硫酸鎂2.2；115 ℃滅菌30 min.初始發酵培養基（g/L）：葡萄糖60.0，棉籽粉22.5，豆餅粉5.0，可溶性淀粉100，碳酸鈣5.0，油酸甲酯42.0 mL/L.用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調整pH至7.2，115 ℃滅菌30 min.

1.2 方法

1.2.1 培養方法 將刺糖多孢菌菌株從-80 ℃超低溫冰箱中取出，以1%（體積比，下同）接種到裝有50 mL種子活化培養基中，280 r/min，30 ℃振蕩培養48 h，作為種子液.種子液以10%接種于裝有20 mL發酵培養基中，280 r/min，30 ℃振蕩培養，無特殊說明則培養240 h.

1.2.2 發酵樣品分析與檢測方法 發酵液的多殺菌素含量通過高效液相色譜分析檢測[18].

1.3 實驗設計

1.3.1 Plackett-Burman試驗設計 試驗設計因子及水平見表1和表2.選擇N=12的試驗設計，見表3，誤差列是“虛擬變量”，用于估計誤差.在Design-Expert 8.06中進行Plackett-Burman試驗設計與結果分析.

1.3.2 Box-Behnken試驗設計 本實驗通過Plackett-Burman試驗設計確定了玉米漿、可溶性淀粉和丙酸鈉的質量濃度是對刺糖多孢菌發酵多殺菌素有重要影響的因子.進行Box-Behnken試驗時，每個因子取3個水平對應編碼值為（-1，0，1），見表2.試驗點共17個，包括12析因點和用于估計實驗誤差的5個重復的零點實驗.Box-Behnken試驗因素水平如表2.

1.4 優化方法

1.4.1 響應面模型 基于Box-Behnken試驗數據進行響應面建模（Response Surface Model， RSM）：

y是方程預測值（多殺菌素產量，mg/L），β0是常數；βi，βii，βij分別為一次項系數，二次項系數和交互項系數；xi和xj為自變量（培養基組分濃度，g/L）.Box-Behnken試驗結果的方差分析以及回歸分析在Design-Expert 8.06軟件中進行.

.4.2 神經網絡模型 本研究創建了一個3-10-1型的前饋反向傳播（BP）網絡（圖1），以Box-Behnken試驗結果作為訓練和驗證數據，BP神經網絡的誤差函數作為遺傳算法的適應度函數，對BP神經網絡的權值和閾值進行優化.再以優化的BP網絡模型，作為循環算法的函數進行循環尋優，考察自變量X1（玉米漿濃度），X2（可溶性淀粉濃度）和X3（丙酸鈉濃度）對多殺菌素的影響.遺傳算法初始設置：迭代次數為10，種群規模為50，交叉概率為03，變異概率為0.1.建模過程在Matlab 2015b中進行.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

經前期實驗發現，玉米漿、可溶性淀粉、氯化鋇、油酸丁酯對多殺菌素合成有促進作用.本研究中，通過單因子實驗初步分析了玉米漿、可溶性淀粉、氯化鋇、油酸丁酯對多殺菌素發酵產量的影響.由圖2可知，玉米漿為7 g/L時，多殺菌素產量達到215.9 mg/L（圖2A）；可溶性淀粉15 g/L時，多殺菌素產量達到282.4 mg/L（圖2B）；油酸丁酯30 mL/L時，多殺菌素產量達到244.3 mg/L（圖2C）；氯化鋇濃度為3 mmol/L時，多殺菌素產量達到304.1 mg/L（圖2D）.

2.2 Plackett-Burman試驗設計及結果

Plackett-Burman試驗設計結果見表3，方差分析結果見表4.由表4可知，模型P=0.009 2，該模型是極顯著的，同時決定系數R2為0.987 3，說明該模型回歸有效，試驗設計可靠.方差分析中各組分所對應P值越小，說明此組分對刺糖多孢菌合成多殺菌素影響越大.因此各組分重要性順序為：ρ（可溶性淀粉）（P=0.002 5），ρ（玉米漿）（P=0.007 4），ρ（丙酸鈉）（P=0.007 7），ρ（酵母粉）（P=0.015 1），ρ（豆餅粉）（P=0028 9），φ（油酸丁酯）（P=0.039 7），c（氯化鋇）（P=0.091 0），ρ（棉籽粉）（P=0.598 6）.因為超過3個因子的Box-Behnken試驗設計實驗組數將大大增加，所以選擇前三個影響達到極顯著的培養基組分進行后續的研究.endprint

2.3 響應面分析

Box-Behnken試驗設計及結果見表5，方差分析結果見表6.由表6可見，模型失擬項（P=0.451 5>005）差異不顯著，說明回歸方程的失擬平方和基本是由實驗誤差等偶然因素引起的，需要進一步檢驗方程回歸結果是否顯著.回歸模型P<0.000 1，說明回歸方程描述各因子與響應值之間關系時，其因變量與全體自變量之間的線性關系是極其顯著的，即該實驗方法可靠；分析得到一個多殺菌素產量對玉米漿、可溶性淀粉和丙酸鈉的二次多項式回歸模型為：

回歸方程的復相關系數R2=0.990 6，說明響應值的變化有99.06%來源于所選因素，該模型能較好地描述試驗結果；預測相關系數R2（0.924 6）與調整相關系數R2（0.978 5）一致，這說明觀測值與預測值高度相關，此模型可用來分析和預測玉米漿、可溶性淀粉和丙酸鈉濃度對刺糖多孢菌發酵多殺菌素產量的影響.由該方程預測的最優培養基各組份濃度見表7，經驗證多殺菌素產量達到（538.60±8.60）mg/L.

2.4 遺傳算法優化BP神經網絡

BP神經網絡的誤差函數作為遺傳算法的適應度函數，對BP神經網絡的權值和閾值進行優化，發現群體進化到第6代時其平均適應度不再改變，至第10代時進化終止（圖3），此時BP神經網絡的訓練樣本和驗證樣本的擬合系數分別達到0.992 6和0.996 5，均方誤差均小于0.023（圖4），說明該模型能夠很好地描述實驗因素（玉米漿、可溶性淀粉、丙酸鈉質量濃度）與多殺菌素產量間的相互關系.

2.5 基于優化后的BP網絡的尋優分析

采用循環計算的方法，以訓練好的BP神經網絡作為目的函數，將所有能夠操作的變量組合輸入到訓練好的BP神經網絡中，計算所得培養基組分為：玉米漿7 g/L，丙酸鈉2 g/L，可溶性淀粉16 g/L時有最高多殺菌素產量，經發酵驗證，此時多殺菌素產量為550.22±3.84 mg/L，將響應面法優化配方下刺糖多孢菌發酵多殺菌素產量與此配方下產量進行獨立樣本t檢驗，結果表明差異顯著（P=0.047<0.05）.

3 結論與討論

放線菌次生代謝產物的生物合成是一個復雜的過程，它取決于前體物質、能量供應、酶活性、細胞狀態和培養條件等因素，且這種影響往往是非線性的.在多殺菌素工業化發酵過程中，通過優化培養條件，有利于節省成本，提高經濟效益.RSM和Artificial Neural Network（ANN）是常用的非線性數據建模和過程優化的分析工具.相比RSM，ANN具有明顯的優勢：不必知道分析函數的確切形式.Box-Behnken設計是響應面設計中最常使用的一種.在本研究中，基于Box-Behnken設計結果建立RSM和ANN模型，實現了對刺糖多孢菌多殺菌素發酵培養基成分的優化.在優化過程中，模型能否高精度預測真實響應至關重要.相比RSM，ANN模型對實驗數據的預測值更接近實驗觀測值（圖5，表7），說明ANN模型比RSM模型擬合效果更好.基于遺傳算法優化的ANN模型尋優，驗證最高多殺菌素產量為550.22 mg/L，高于由RSM模型所確定的多項式方程預測結果（表7），說明ANN模型有更好的泛化能力.類似的結果表明[13，20-21]，神經網絡模型在組分復雜的培養基優化過程中，相比響應面分析法更有優勢.優化培養基通常被稱為提高發酵目的產物產量的初始步驟，然而，利用遺傳算法優化BP神經網絡的建模方法，在多殺菌素的發酵過程優化中鮮有報道.本研究通過此方法成功優化了刺糖多孢菌發酵多殺菌素的培養基，在培養基優化方法的選擇上具有一定的參考意義.

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