溫針灸對類風濕關節(jié)炎大鼠關節(jié)軟骨vimentin蛋白的影響

蔡國偉,彭銳,李佳,李靜

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院,武漢 430022;2.湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430061)

溫針灸對類風濕關節(jié)炎大鼠關節(jié)軟骨vimentin蛋白的影響

蔡國偉1,彭銳2,李佳2,李靜1

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院,武漢 430022;2.湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430061)

目的探討溫針灸對類風濕關節(jié)炎(RA)大鼠關節(jié)軟骨vimentin蛋白的影響以及對炎性因子的調節(jié)作用。方法將40只SD大鼠(雌雄各半)隨機分為正常組、模型組、針刺組和溫針灸組,每組10只。采用皮內注射牛Ⅱ型膠原接種誘發(fā)制備大鼠RA模型,共21 d。溫針灸組于造模第1天取足三里、腎俞和懸鐘穴進行溫針灸(手針配合懸灸)治療,針刺組采用單純針刺治療,共治療 21 d。所有大鼠于相應處理結束后,采用排水法測大鼠膝關節(jié)部體積,放免法檢測血清炎性因子IL-1β和IL-4含量,免疫組化法檢測膝關節(jié)滑膜組織vimentin蛋白的表達。結果與正常組相比,模型組大鼠膝關節(jié)腫脹明顯,血清中炎性因子IL-1β含量較高,IL-4含量較低,膝關節(jié)滑膜組織 vimentin蛋白表達升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與模型組相比,針刺組和溫針灸組大鼠膝關節(jié)腫脹改善明顯,炎性因子IL-1β含量減少,IL-4含量升高,vimentin蛋白表達降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與針刺組相比,溫針灸組大鼠膝關節(jié)腫脹改善程度較好,血清中炎性因子 IL-1β含量顯著降低,IL-4含量顯著升高,膝關節(jié)滑膜組織vimentin蛋白表達增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論溫針灸能有效調節(jié)RA大鼠關節(jié)炎性損傷狀況,降低RA大鼠血清炎性因子和骨關節(jié)滑膜組織viemtnin蛋白表達,這可能是溫針灸通過調節(jié)vimentin蛋白改善RA炎性損傷的調節(jié)機制之一,同時溫針灸治療RA療效優(yōu)于針刺治療。

針灸療法;關節(jié)炎,類風濕;溫針療法;針刺;波形蛋白

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種退行性病變,以慢性、進行性、侵襲性關節(jié)炎為主要表現(xiàn),患者臨床大多表現(xiàn)為關節(jié)疼痛和關節(jié)腫脹、畸形以及功能活動受限。隨著社會老齡化進程日趨加劇,骨關節(jié)炎發(fā)病率逐年增加,已經演變成為嚴重的社會問題,值得廣泛關注。然而其發(fā)病機制尚未完全闡明。骨關節(jié)炎的臨床治療經過幾十年的探索,盡管有了許多治療理念,但仍未找到一種能徹底阻斷骨關節(jié)炎的發(fā)展進程的治療方式[1]。溫針灸治療 RA歷史悠久,早期介入治療RA可以起到疏經通絡、疏風散寒、利濕止痛等作用,從而阻止病情的發(fā)展。早期已有研究證明溫針灸治療該病的有效性,并受到醫(yī)療界的廣泛認可,值得臨床上推廣運用[2-3]。

針灸是近年來臨床應用較多的,療效顯著,但其作用機制有待于闡明。大量臨床資料顯示,采用多種針灸治療方法,如針刺[4]、蜂針[5]、溫針[6]、麥粒灸[7]、電熱灸等治療骨關節(jié)疾病獲得較為滿意的療效,研究從不同角度發(fā)現(xiàn)針灸治療能促進軟骨的代謝水平和炎性物質的吸收,抑制關節(jié)液中的白介素類細胞因子水平以及滑膜組織一氧化氮的過度生成,從而減輕關節(jié)軟骨病變。然而,針灸對RA病理過程中軟骨細胞的調節(jié)作用以及抑制炎癥反應的機制究竟如何,目前仍未完全闡明。因此,本研究希望在既往研究基礎上,從RA大鼠關節(jié)軟骨細胞vimentin蛋白的表達變化入手,進一步探討溫針灸對 RA大鼠軟骨細胞骨架蛋白調控作用的可能機制,并比較溫針灸方法和針刺方法的療效差異,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

40只清潔級 3月齡 SD大鼠,雌雄各半,體重為(211±5.7)g,由湖北省醫(yī)學科學研究院實驗動物中心提供[SCXK(鄂)2004-0007號]。動物喂養(yǎng)在湖北中醫(yī)藥大學針灸研究所實驗室完成,環(huán)境溫度 21℃～25℃,濕度為40%～60%。光照時間每日12 h,大鼠可自由攝食飲水。本實驗嚴格按照科技部[(2006)398號]《關于善待實驗動物的指導性意見》文件要求進行實驗。將40只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、針刺組和溫針灸組,每組10只。

1.2 主要試劑及儀器

牛Ⅱ型膠原蛋白-溶液(美國SouthernBiotech公司);Vimentin抗體(美國Abcam公司);放射免疫分析試劑盒(北方生物技術研究所)。

0.30 mm×15 mm華佗牌毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);Axiovert 40CFL顯微鏡(德國 ZWISS); HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術有限公司);Gc911放射免疫γ計數(shù)器(中國科技大學中佳公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備[8]

取適量牛Ⅱ型膠原溶于 0.5 mol/L乙酸中(2 mg膠原/mL),在 4℃下過夜溶化,再與等量弗氏不完全佐劑在冰浴下充分乳化制成乳劑。在 10%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(100 g/0.3 mL)下,每只大鼠每日以0.1 mL乳劑(200 μg膠原),在足底部作皮內注射接種誘發(fā),連續(xù)21 d,關節(jié)病變程度以排水法測足部體積評估。

1.3.2 分組治療

溫針灸組治療時,為便于操作,需固定動物,大鼠穿自制鼠衣,參照中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“實驗動物針灸穴位圖譜”取雙側足三里、腎俞和懸鐘穴。采用0.30 mm×15 mm毫針進行針刺,針刺深度約為5 mm,強度以大鼠耐受為度,然后用特制香煙型純艾條離穴位2 cm處進行懸灸。每日1次,每次15 min,治療從造模后第1天開始至第21天結束,共21次。針刺組于造模同時給予針刺治療,針刺方法同溫針灸組,不使用艾灸治療。其余兩組大鼠采用常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 觀察指標

1.4.1 足部體積

采用排水法測量大鼠足部體積[9],將大鼠足部插入灌滿水的特制量筒,在水面與膝關節(jié)上2 cm處持平,另用一個燒杯接從量筒側口排出的水,排出水的體積即為所測大鼠足跖部的體積。分別測量第1、3、7、14天排水體積,每只大鼠每次分別測量3次,取其均值。

1.4.2 IL-1β和IL-4含量

相應處理結束,大鼠于第21天行腹腔麻醉(10%戊巴比妥鈉,100 g/0.3mL)后心內采血,所采血液于潔凈干燥 EP管內靜置 1 h后,上離心機分離血清(3000 rpm,10 min),即得血清,再采用放免法檢測 IL-1β和IL-4含量,實驗操作同前[10]。

1.4.3 免疫組化法

實驗操作步驟同前[11],關節(jié)軟骨組織切片的制備操作如下,大鼠經腹腔麻醉后迅速開胸暴露心臟,先用4℃ 0.9%氯化鈉溶液250 mL快速沖管,再灌注4℃ 4%多聚甲醛溶液 500mL,先以 150 mL快速灌注,再以350 mL緩慢滴注。灌注結束后打開大鼠膝關節(jié)腔,于股骨髁上約5 cm處截取股骨,于脛骨平臺下3 mm截取脛骨,小心取下膝關節(jié),去除周圍軟組織后剪開髕骨兩側腱膜,將髕骨向下翻轉,打開膝關節(jié),手術刀削取關節(jié)軟骨組織修塊后入 4%多聚甲醛溶液固定過夜,24 h內行常規(guī)固定,脫鈣,石蠟包埋,切片。運用免疫組化SABC法檢測關節(jié)軟骨中 vimentin蛋白的表達,采用Axiovert 40CFL顯微鏡和HPIAS-2000彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行圖像采集和分析,測量vimentin陽性反應物平均光密度(MOD),每組切片的每個部位測3個視野,100倍鏡下檢測各片的MOD值,分別測定,累加取均值。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較運用單因素方差分析,組間兩兩比較,方差齊性時采用LSD檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清IL-1β和IL-4含量比較

RA模型大鼠血清中IL-1β含量較正常大鼠明顯增加(P＜0.01),IL-4含量減少(P＜0.01);針刺和溫針灸均能降低大鼠血清中IL-1β含量和提高IL-4水平,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與針刺組相比,溫針灸組大鼠血清中 IL-1β含量降低更為顯著,而IL-4水平偏高,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β和IL-4含量比較(±s,ng/mL)

表1 各組大鼠血清IL-1β和IL-4含量比較(±s,ng/mL)

注:與正常組比較 1)P＜0.01;與模型組比較 2)P＜0.05;與針刺組比較3)P＜0.05

組別 n IL-1β IL-4正常組 10 22.24±5.26 79.28±5.02模型組 10 55.17±5.121) 35.33±4.371)針刺組 10 44.27±2.672) 52.17±5.112)溫針灸組 10 37.84±8.262)3) 61.74±4.462)3)

2.2 各組大鼠膝關節(jié)關節(jié)軟骨組織vimentin蛋白表達比較

免疫組化檢測顯示,vimentin蛋白在軟骨組織中廣泛表達,呈深棕色。模型組大鼠vimentin表達最高,與正常組比較,差異具有顯著性(P＜0.01);與模型組比較,針刺組和溫針灸組vimentin蛋白表達水平降低,差異具有顯著性(P＜0.05);與針刺組比較,溫針灸組vimentin蛋白表達水平降低,表達差異具有顯著性(P＜0.05)。詳見表2、圖1。

表2 各組大鼠膝關節(jié)關節(jié)軟骨組織vimentin蛋白表達比較 (±s,%)

表2 各組大鼠膝關節(jié)關節(jié)軟骨組織vimentin蛋白表達比較 (±s,%)

注:與正常組比較 1)P＜0.01;與模型組比較 2)P＜0.05;與針刺組比較3)P＜0.05

組別 n vimentin蛋白表達正常組 10 100.24±18.26模型組 10 241.17±35.161)針刺組 10 196.05±22.332)溫針灸組 10 170.34±25.682)3)

圖1 各組免疫組化檢測(×100)

2.3 各組大鼠關節(jié)腫脹程度比較

21 d模型制備過程中,除正常組大鼠外,其余各組大鼠第3天關節(jié)腫脹程度顯著高于正常組(P＜0.01),其中模型組大鼠關節(jié)腫脹程度最為顯著;針刺和溫針灸治療后,關節(jié)腫脹程度變小,于第12天開始,與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05);針刺組與溫針灸組之間比較,于第 15天開始呈現(xiàn)顯著性變化,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠不同時間關節(jié)腫脹程度比較 (n=10)(±s,mm3)

表3 各組大鼠不同時間關節(jié)腫脹程度比較 (n=10)(±s,mm3)

注:與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05;與針刺組比較3)P＜0.05

組別 造模前 造模第3天 造模第6天 造模第9天 造模第12天 造模第15天 造模第18天 造模第21天正常組 1.20±0.04 1.22±0.05 1.23±0.04 1.26±0.04 1.28±0.05 1.30±0.03 1.32±0.04 1.32±0.06模型組 1.21±0.04 1.78±0.261) 1.75±0.231) 1.68±0.181) 1.70±0.151) 1.80±0.171) 2.02±0.201) 2.20±0.191)針刺組 1.21±0.05 1.79±0.251) 1.75±0.221) 1.72±0.201) 1.67±0.141)2) 1.64±0.151)2) 1.82±0.181)2) 1.68±0.141)2)溫針灸組 1.20±0.05 1.81±0.281) 1.76±0.261) 1.63±0.171) 1.61±0.181)2) 1.55±0.131)2)3) 1.64±0.151)2)3) 1.60±0.151)2)3)

3 討論

類風濕關節(jié)炎是一種多好發(fā)于手、足、腕等小關節(jié)的慢性炎癥疾病,早期臨床癥狀主要有關節(jié)腫脹熱痛及功能障礙,晚期則表現(xiàn)為關節(jié)僵硬,致殘率非常高[12-13]。患者往往晨起疼痛加重,并伴有晨僵,且疼痛發(fā)作時,伴隨關節(jié)無力、肌肉萎縮等表現(xiàn)。美國疾病與控制中心早已報告,與RA相關的生活時間風險評估在女性中占4%,男性占3%[14]。由于不能獲得有效的藥物來治療 RA,因此只能使用對癥藥物如甲氨蝶呤、萘普生、免疫抑制劑(環(huán)磷酰胺)等來減緩癥狀和減輕關節(jié)殘疾。然而,這些藥物具有各種副反應,如胃腸道不適、潰瘍、腎毒性、肝毒性等[15]。考慮到西藥治療本病毒副反應大且易產生耐藥性的弊端,使用針灸的方法顯得更為經濟及有效。

RA屬中醫(yī)學“尪痹”“痹證”范疇,此乃脾胃虛弱,陽氣不足,衛(wèi)外無力,風寒濕火等毒邪入侵,流于經絡,機關不利所致。古代醫(yī)家很早就對本病作了詳細的研究,《諸病源候論》:“痹者,風寒濕三氣雜至,合而成痹……病在陽曰風,在陰曰痹,陰陽俱病曰風痹。”《濟生方·痹》:“皆因體虛,腠理空疏,受風寒濕氣而成痹也。”脾胃健實,則正氣存內,邪不可干,病久脾胃虛弱,氣血不足,肝腎陰虛,故針灸治療原則為補腎益氣,溫經通絡除濕,標本兼治。足三里為多氣多血之足陽明經合穴,有調理脾胃、通暢氣機、通經活絡之功效;腎俞穴能補腎氣、益陰陽、強腰健骨;懸鐘乃髓會,膽經之穴,主骨所生病。三穴配伍,共奏補益先天與后天之功效,配合局部取穴,可疏通經絡,祛邪外出,最終達到正勝邪退之目的,從而改善癥狀。

RA作為一種免疫性疾病,其特征在于滑膜的慢性炎癥,血管形成增加、骨侵蝕和炎性細胞浸潤。應用廣泛且較為成熟的動物模型是膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)和佐劑性關節(jié)炎(AA),均為較理想的模型。但AA與CIA模型相比,AA模型的病理切片中主要表現(xiàn)為大量炎性細胞浸潤,滑膜增生和軟骨破壞等現(xiàn)象不如 CIA模型明顯,并且缺乏慢性病理過程。CIA大鼠的免疫功能變化兼有體液免疫和細胞免疫的優(yōu)點,體內可檢出針對自身Ⅱ型膠原的高滴度的IgG抗體,與人類RA免疫變化相似[15]。故CIA模型更接近于人類RA的臨床特點、病理表現(xiàn)及免疫改變,成為研究 RA的經典動物模型。1977年Trentham DE等[16]首次發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原,并成功誘導了RA模型SD大鼠。近年來的研究逐漸證明,平滑肌肌動蛋白聚合和解聚、細胞骨架波形蛋白vimentin的重組,平滑肌細胞收縮動力學過程與這兩種功能的行使有密不可分的關系[17-19]。而且我們最近的研究[20-21]也發(fā)現(xiàn),平滑肌細胞骨架調節(jié)蛋白引起vimentin的磷酸化從而影響該蛋白的重組,進而調節(jié)平滑肌細胞收縮[22-23]。但之前對其在炎癥方面的作用研究較少,有實驗表明,波形蛋白能夠影響調控平滑肌細胞炎性小體形成及活性[24]。Vimentin通過不同途徑調控著細胞多種功能,與類風濕關節(jié)炎、白內障、丙型肝炎以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關[25]。目前大多數(shù)研究人員認為免疫異常及感染因子參與 RA的發(fā)病[26]。IL-4作為Th2細胞的特征細胞因子,在以Th2為特征的炎癥反應中有促進其發(fā)生發(fā)展的作用。Lübbers J等[27]認為局部IL-4治療可阻止關節(jié)損傷和骨侵蝕,這種保護作用與破骨樣細胞形成因子IL-17、IL-6、IL-12以及關節(jié)炎骨蛋白整合素下調有關。IL-1β是一種具有廣泛生物學活性的促炎性細胞因子,可以調節(jié)多種細胞因子、細胞黏附分子、免疫調節(jié)分子和前炎性介質的表達。在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。已有研究[28]發(fā)現(xiàn),IL-1β基因多態(tài)性影響疾病對治療的反應。IL-1β是參與RA滑膜炎癥和軟骨、骨破壞的主要炎性介質,血清 IL-l的水平與RA的活動性及組織形態(tài)學特征密切相關。

本實驗研究結果提示,RA模型組關節(jié)腫脹明顯,表明皮下注射牛Ⅱ型膠原蛋白造成大鼠骨關節(jié)炎性損傷。溫針灸組能夠顯著降低骨關節(jié)腫脹指數(shù)以及血清IL-1β水平,提高 IL-4表達,從而改善關節(jié)炎損傷狀況。模型組與正常組相比,膝關節(jié)中vimentin在軟骨組織中表達變化異常,提示骨架蛋白vimentin參與了RA的發(fā)生。因此,本研究認為有效調節(jié)該蛋白可以有效抑制RA炎性損傷的發(fā)生。同時本實驗發(fā)現(xiàn)針刺或溫針灸干預下的膝關節(jié)軟骨組織vimentin表達減少,并且溫針灸效果更佳,提示溫針灸足三里、腎俞和懸鐘穴能夠調節(jié)蛋白 vimentin,這可能是其抗類風濕的新機制。但是溫針灸通過怎樣的途徑來調節(jié)該蛋白,目前尚不清楚,須進一步研究。

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Effect of Warm Needling Moxibustion on Articular Cartilage Vimentin in Rats with Rheumatoid Arthritis

CAI Guo-wei1,PENGRui2,LIJia2,LIJing1. 1.Huazhong University of Science and Technology Tongji Medical School Union Hospital,Wuhan430022,China; 2.Hubei University of Traditional Chinese Medicine School of Acupuncture and Traumatology/Hubei Collaborative Innovation Center of Acupuncture Prevention Treatment of Diseases,Wuhan430061,China

ObjectiveTo investigate the impact of warm needling moxibustion on articular cartilage vimentin and the regulating effect on inflammatory factors in rats with rheumatoid arthritis (RA).MethodsForty SD rats (half male and half female) were randomized to normal, model, acupuncture and warm needling moxibustion groups, 10 rats each. A rat model of RA was made by intradermal injection of bovine type Ⅱ collagen for 21-day inoculation inducement. At one day after model making, the warm needling moxibustion group was treated with warm needling moxibustion on points Zusanli, Shenshu and Xuanzhong (manual needling plus suspended moxibustion) and the acupuncture group, with acupuncture alone, for a total of 21 days. In all the rats after the completion of corresponding treatments, knee joint volume was measured by drainage, serum inflammatory factors IL-1β and IL-4 contents were determined by radioimmunology and the expression of vimentin in knee joint synovium was examined by immunehistochemical method.ResultsAs compared with the normal group, knee joint swelling was marked, serum inflammatory factors IL-1β and IL-4 contents were higher and the expression of vimentin in knee joint synovium increased in the model group of rats. There were statistically significant differences (P＜0.01). As compared with the model group, knee joint swelling improved markedly, inflammatory factor IL-1β content decreased, IL-4 content increased and vimentin expression decreased in the acupuncture and warm needling moxibustion groups of rats. There were statistically significant differences (P＜0.05). As compared with the acupuncture group, knee joint swelling improved more, serum inflammatory factor IL-1β content decreased significantly, IL-4 content increased significantly and the expression of vimentin in knee joint synovium increased in the warm needling moxibustion group of rat. There were statistically significant differences (P＜0.05).ConclusionsWarm needling moxibustion can effectively reduce articular inflammatory injury and decrease serum inflammatory factors and the expression of vimentin in knee joint synovium in RA rats. Regulating vimentin may be one of the mechanisms by which warm needling moxibustion reduce RA inflammatory injury. Warm needling moxibustion is more effective than acupuncture in treating RA.

Acupuncture-moxibustion therapy; Arthritis, rheumatoid; Warm needling moxibustion; Acupuncture; Vimentin

1005-0957(2017)11-1361-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.11.1361

國家自然科學基金項目(81403485,81774410);湖北省自然科學基金項目(2016CFB221;2015CKB745)

蔡國偉(1964—),男,主任醫(yī)師,碩士生導師,Email:cgw645@163.com

李靜(1982—),女,主治醫(yī)師,博士,Email:461688459@qq.com

2017-06-02