磷素對小麥（Triticum aestivum L.）淀粉粒微觀特性的影響及其形成機理

張潤琪，付凱勇，李超，祖賽超，李春艷，李誠

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磷素對小麥（L.）淀粉粒微觀特性的影響及其形成機理

張潤琪，付凱勇，李超，祖賽超，李春艷，李誠

（石河子大學農學院/新疆兵團綠洲生態農業國家重點實驗室培育基地，新疆石河子 832000）

磷是小麥生長發育必需的三大營養元素之一。小麥淀粉粒表面存在微孔和微通道結構，對淀粉的生物合成和理化特性有重要影響。探索磷素對淀粉粒微觀特性的影響及其形成機理，可為研究不同磷素條件下小麥淀粉的生物合成及品質變化機理提供新途徑。采用新疆冬小麥主栽品種新冬23號為參試材料，設置3種施磷水平，不施磷（CK：P2O50 kg·hm-2）、常規施磷（CP：P2O5105 kg·hm-2）和高量施磷（HP：P2O5210 kg·hm-2），所用肥料為重過磷酸鈣，于小麥播種后160 d（大約5%的植株已返青）開溝條施，并于花后7、14、21、28和35 d取樣。通過掃描電鏡觀察不同磷素水平成熟期淀粉粒微觀結構以及淀粉粒在內源（種子萌發）和外源淀粉酶（淀粉葡萄糖苷酶）酶解條件下的形態變化，同時測定淀粉粒經淀粉葡萄糖苷酶水解后產生的還原糖濃度；通過激光共焦顯微鏡觀察淀粉粒微通道結構的變化；通過實時熒光定量PCR研究籽粒發育過程中淀粉合成酶與降解酶基因表達量，并通過原位雜交技術對淀粉降解酶關鍵基因進行定位。不同磷素條件下小麥胚乳淀粉粒形態未發生明顯改變，但CP處理條件下更容易觀察到淀粉粒的微孔結構，且其內部顯示出較多熒光；另外，籽粒發芽6 d時，CP處理條件下淀粉粒表面的孔洞最多。經外源淀粉葡萄糖苷酶處理后，HP和CP處理條件下更容易觀察到被水解成兩半的A型淀粉粒，同時其產生的還原糖濃度也顯著提高，這說明不同磷素條件下淀粉粒表面和高部微觀結構發生了變化。常規施磷條件下，小麥胚乳淀粉合成與降解相關酶基因的表達量顯著高于不施磷和高量施磷。施磷條件下胚乳外緣、和轉錄水平提高，且常規施磷條件下轉錄水平更高。常規施磷條件下胚乳邊緣淀粉酶基因轉錄水平的提高可能影響了淀粉合成酶和降解酶之間的平衡，進而影響淀粉粒的合成和微觀特性變化。

普通小麥；淀粉粒；磷素；微觀結構；基因表達；原位雜交

0 引言

【研究意義】磷素是小麥生長過程中重要的大量元素之一，對小麥籽粒產量和淀粉品質的形成有重要的調控作用。但是，新疆大部分耕地土壤肥力較差，磷素缺乏，長期以來，大量施用磷肥已成為緩解土壤磷素脅迫、實現小麥高產穩產的重要措施之一。然而，面對即將枯竭的磷礦資源和大量施用磷肥帶來的環境風險，深入細化地研究磷素對小麥淀粉產量和品質形成的作用具有重要意義。小麥淀粉粒表面存在微孔和微通道結構，是外界酶、酸、水等物質與淀粉粒首要的作用位點[1]，因此，微通道的數量和結構可影響工業中對特殊淀粉的要求[2-3]。探索磷素對淀粉粒微觀特性的影響及其機理可為不同磷營養條件下小麥淀粉的生物合成及品質變化機理的研究提供新途徑。【前人研究進展】小麥、玉米和高粱等禾本科作物淀粉粒表面均能觀察到微孔和微通道[1,4]。微通道的直徑一般約為100 nm，表面的微孔與內部蜿蜒的通道相通并一直延伸到臍點，這種結構是淀粉粒本身的屬性特征[5]。淀粉粒晶體一般分為五級結構，其四級結構——淀粉小體是構成淀粉粒的基本單元，從其中“缺陷小體”的角度可以在結構上解釋淀粉粒微孔和微通道的形成[6]。Gray[7]研究發現在玉米微通道中存在蛋白、磷脂、微管物質和微纖維等。Fannon等[8]提出假設，在玉米和高粱胚乳的造粉體中存在微管，這些微管以淀粉發生中心（淀粉粒臍點）呈放射狀向外與質體被膜相連，淀粉分子逐漸以微管為中心發育形成淀粉粒，最終淀粉粒微通道成為造粉體微管的殘體。迄今為止，關于小麥淀粉粒微通道的起源及生物學意義的研究鮮見報道。前人及石河子大學農學院冬小麥課題組研究發現，外界高溫、干旱等環境因素對玉米和小麥籽粒淀粉合成以及淀粉粒表面的微孔和微通道結構有一定的影響[9-11]，并認為微通道的形成可能與淀粉降解酶和合成酶之間的平衡被打破有關。胚乳發育過程中淀粉的生物合成是一個復雜的生物學過程，涉及眾多酶的共同作用，包括淀粉合成酶[12]以及淀粉降解酶[13-14]。Benmoussa等[15]發現在玉米淀粉粒的微通道蛋白中包含淀粉合成的關鍵酶-腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）和顆粒淀粉合成酶（GBSS）。基于此研究，推斷微通道結構對淀粉合成以及淀粉粒形態建成有重要意義。施磷肥是改善土壤磷脅迫、提高小麥產量和品質的有效途徑。然而，過量施磷會對經濟發展和生態環境帶來一定的負面效應。AGPase是淀粉合成的關鍵酶之一，其活性受3-磷酸甘油酸和無機磷酸的影響，其中無機磷酸對該酶活性有抑制作用，從而影響淀粉的合成[16]。Ni等[17]研究發現施磷顯著提高了成熟期小麥籽粒中的總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。石河子大學農學院冬小麥課題組前期研究表明，施磷顯著提高了新冬20號小麥籽粒淀粉中B型淀粉粒的比例[18]，并對淀粉粒微觀結構有顯著影響。【本研究切入點】目前，盡管關于小麥淀粉粒微通道結構的形態及其對淀粉理化性質的影響已有研究報道，然而，關于小麥淀粉粒微孔和微通道的生物學意義和起源的研究卻鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究采用新疆冬小麥主栽品種新冬23號，研究不同磷素水平下淀粉粒微觀結構、淀粉合成酶與降解酶相關基因的表達以及α和β-淀粉酶關鍵基因的變化，旨在探究磷素對淀粉粒微觀特性的影響及形成機理，為進一步研究小麥淀粉生物合成提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設計

供試材料選用新疆主栽冬小麥品種新冬23號，種子由石河子大學麥類作物研究所提供。

試驗材料于2014年10月至2015年6月種植在石河子大學農學院試驗站（44°17′N, 86°03′E）。試驗地前茬為向日葵，土壤為灰漠土。0—20 cm土層含堿解氮63 mg·kg-1、速效磷15 mg·kg-1、速效鉀208 mg·kg-1。播種時按75 kg·hm-2施加尿素，灌溉方式為滴灌，冬前澆水3次，返青至成熟每隔10—12 d澆水1次，共澆6次。在拔節期、抽穗期和揚花期分別按45、75和120 kg·hm-2將尿素隨水施入。

試驗為隨機區組設計，每個處理重復3次，小區面積2.4 m×3 m，小區之間設置寬度為50 cm的隔離帶。設3個磷素供應水平，施磷量（以P2O5計）分別為0、105和210 kg·hm-2，分別用CK（對照）、CP（常規施磷）和HP（高量施磷）表示，所用肥料為重過磷酸鈣，播種后160 d（大約5%的植株已返青）開溝條施。CK用同樣方式開溝，但不施磷肥。

1.2 取樣

取同日開花的麥穗掛牌標記，分別在花后7、14、21、28和35 d取樣。取樣時剝取穗中部的籽粒，一部分經液氮速凍后-80℃保存；另一部分于105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重備用。

1.3 淀粉粒的提取及形態觀察

取小麥籽粒置于去離子水中4℃過夜，剝去果種皮，切除胚，研磨成勻漿。淀粉粒的提取過程參照Peng等[19]的方法。通過離子濺射儀（DentonVacuum- Moorestown，USA）將提取純化的淀粉粒鍍金膜，然后用掃描電鏡（JEOL JFC-1600，Japan）觀察拍照，加速電壓5—15 KV。

1.4 淀粉粒的酶解

1.4.1 淀粉粒內源酶解試驗（小麥種子萌發試驗） 3種磷素條件下，待籽粒成熟后，選取籽粒飽滿度一致的小麥種子，用0.1%氯化汞溶液消毒15 min，蒸餾水漂洗3次，每次5 min，用濾紙吸干附著水。將種子均勻擺放在鋪兩層濾紙的滅菌發芽盒中，每盒種50粒，25℃暗培養。每天用蒸餾水澆灌，保持濕潤。2 d后于人工氣候室培養，光照16 h，溫度28℃；暗培養8 h，溫度16℃。于第6天取樣。提取胚乳淀粉粒，通過掃描電鏡觀察、拍照。

1.4.2 外源蛋白酶酶解 取2 g淀粉粒懸浮于40 mL酶解緩沖液中，加入蛋白酶XIV（196 U·g-1淀粉，sigma，USA，來源：灰色鏈霉菌），置于4℃搖床200 r/min振蕩24 h，于4℃ 4 000r/min離心20 min，收集淀粉粒，去離子水漂洗3次，酒精漂洗1次，用布氏漏斗收集淀粉粒，室溫晾干。

1.4.3 外源淀粉葡萄糖苷酶酶解 準確稱取25 mg淀粉粒于2 mL離心管中，加入1 mL含50 U的淀粉葡萄糖苷酶（Sigma-Aldrich，USA），酶解的具體操作參照Tang等[20]的方法，酶解完成后使用3,5-二硝基水楊酸法測定產生的還原糖濃度[10]，然后將剩余的淀粉粒用掃描電鏡觀察拍照。

1.5 淀粉粒的染色及激光共聚焦顯微鏡觀察

將蛋白酶XIV處理過的淀粉粒用汞溴紅甲醇溶液染色并制成臨時玻片，具體操作過程參照Kim等[1]的方法，再用激光共聚焦顯微鏡（Zeiss, Oberkoche, Germany）觀察、拍照。

1.6 淀粉合成酶與降解酶相關基因的檢測

1.6.1 引物設計 根據NCBI公布的小麥籽粒淀粉合成酶與降解酶相關基因的序列，設計、、、、、、、、、、、、、、、、、和的引物，由上海生工合成。小麥（NCBI DN551593）作為內參基因。通過梯度PCR驗證引物特異性，同時優化PCR條件。

1.6.2 RNA的提取和cDNA的合成 將保存于-80℃的新鮮樣品切除胚，采用Fruit-mate（Takara，9192，Japan）和RNAiso plus（Takara, 9108, Japan）試劑盒提取RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。使用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（Tiangen，KR104-02，China）合成cDNA，以其為模板擴增以檢驗cDNA質量。

1.6.3 實時熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR儀（Roche LightCycler 480 Ⅱ）檢測各基因的表達情況，具體操作按SYBR Premix Ex Taq試劑盒（Takara，RR420A，Japan）說明書進行。

1.7 amy4、bam1和bam5的原位雜交檢測

1.7.1 探針的合成 通過擴增分別獲得、和基因片段，將其與pEASY-T3克隆載體連接，獲得陽性克隆，由上海生工進行測序。提取測序正確的陽性克隆質粒，根據測序結果中片段插入載體的方向，使用Ⅰ（Takara，1160A，Japan，10 U·μL-1）或Ⅰ（Takara，1073A，Japan，15 U·μL-1）限制性內切酶進行酶切線性化，然后用Dig RNA標記試劑盒（Roche，REF11175025910，USA）通過體外轉錄合成探針（表1）。

1.7.2 石蠟切片的制作 石蠟切片的制作參照Ausubel等[21]的方法并加以改進。將-80℃保存的新鮮樣品橫切后置于4%多聚甲醛（含0.1%DEPC，pH 7.2—7.6）中，微真空條件下室溫固定4 h，然后通過梯度濃度（30%—100%）酒精脫水，分別用3﹕1、1﹕1和1﹕3的酒精氯仿混合液逐級透明，每級3 h，再用純氯仿繼續透明3 d。透明的樣品使用一系列氯仿石蠟混合物在不同溫度下（3﹕1，40℃；1﹕1，40℃；1﹕3，45℃）逐級浸蠟，每級4 h，最后將樣品置于純石蠟中55℃繼續浸蠟3 d（花后21 d及之前的籽粒）或5 d（花后28 d和35 d的籽粒）。浸蠟后的樣品按常規方法包埋成蠟塊，然后在石蠟切片機（Kedee，1508A，China）上切成10—25 μm厚的切片（花后28 d和35 d的樣品切片前需要先切出籽粒的橫截面，再將其倒扣于DEPC水中軟化數小時）并轉移到粘附載玻片（Citoglas，REF188105W，China）上。

表1 原位雜交探針序列

1.7.3 原位雜交 石蠟切片經二甲苯脫蠟后復水，然后使用敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅰ，POD（Boster，MK1030，China）進行原位雜交。完成雜交后的切片使用體視顯微鏡（Zeiss Discovery V20，Germany）觀察拍照。

1.8 石蠟切片的I2-KI染色

脫蠟后的切片用I2-KI（0.1%）染色5 min，去離子水沖洗干凈，用體視顯微鏡（Zeiss Discovery V20，Germany）觀察拍照。

1.9 數據分析

使用Microsoft Excel和SPSS 13.0軟件進行數據分析，所有數據為至少3次重復的平均值，采用Duncan法進行多重比較。基因相對表達量按下面的公式計算：

ΔCt(目標基因)=Ct(目標基因)-Ct(同一樣品的) （1）

相對表達量=2-ΔCt (目標基因)（2）

2 結果

2.1 小麥胚乳淀粉粒微觀結構的變化

為探究不同施磷條件下新冬23號小麥淀粉粒的結構特性變化，將提取的淀粉粒進行掃描電鏡觀察。如圖1A-C所示，A型淀粉粒呈圓盤狀，直徑大于10 μm；B型淀粉粒呈球形或不規則形狀，直徑小于10 μm，不同磷處理下淀粉粒形態未發生明顯改變。另外，對比CK和HP處理，CP處理條件下的淀粉粒表面更容易觀察到微孔。

為了更深入觀察磷素對淀粉粒內部微觀結構的影響，將蛋白酶XIV酶解處理的淀粉粒經汞溴紅染色，通過激光共聚焦顯微鏡觀察（圖1-D—F）。CP處理條件下的淀粉粒內部顯示出更多的熒光（圖1-E中箭頭所示），而CK淀粉粒的熒光主要出現在邊緣，HP處理條件下的淀粉粒熒光介于CP和CK之間，說明不同水平磷素條件下小麥淀粉粒內部的微通道結構發生了變化。

A和D、B和E、C和F分別是CK、CP和HP處理條件下籽粒胚乳中淀粉粒。A、B、C是通過掃描電鏡觀察到的淀粉粒，D、E、F是通過激光共聚焦顯微鏡觀察到的經汞溴紅染色的淀粉粒。白框中是表面有微孔的淀粉粒，左下角插入的放大圖（×2000）是紅框中淀粉粒。白色箭頭指向的是淀粉粒中的短通道或空腔（通過微孔連接到外表面）。CK：P2O5 0 kg·hm-2；CP：P2O5 105 kg·hm-2；HP：P2O5 210 kg·hm-2

為進一步研究淀粉粒內部微通道結構的變化，通過掃描電鏡觀察淀粉粒在內源（種子萌發時產生的降解酶）和外源淀粉酶（淀粉葡萄糖苷酶）酶解條件下的形態變化（圖2）。發現小麥籽粒發芽6 d時淀粉粒表面出現數量較多的孔洞，其中CP處理下淀粉粒表面的孔洞最多，說明降解程度最高；HP處理次之；CK淀粉粒表面孔洞較少，降解程度最低（圖2-A—C）。外源淀粉葡萄糖苷酶處理使淀粉粒表面也出現很多孔洞，赤道凹槽重新出現，并使部分淀粉粒分成兩部分（圖2-E、F箭頭所示），B型淀粉粒被降解程度相對較小。相比CK，HP和CP處理下淀粉的酶解程度較強，很容易觀察到被水解成兩半的A型淀粉粒。說明不同磷素供應下原淀粉粒表面和內部結構的變化對酶作用位點的分布和數量有重要影響。

淀粉粒上的微孔和微通道結構可以促進酶、水等物質進入淀粉粒內部[22]，該效應可通過淀粉粒的酶解效率的提高而體現出來[10]。為確定磷處理條件下淀粉粒微孔、微通道的變化是否存在同樣的效應，將相同質量的淀粉粒經淀粉葡萄糖苷酶水解后測定產生的還原糖濃度（表2）。與對照相比，磷處理條件下的淀粉粒水解產生的還原糖濃度顯著提高，且HP處理下的還原糖濃度顯著高于CP處理。此結果驗證了淀粉粒微孔微通道的變化。

A、B、C分別是CK、CP和HP小麥籽粒發芽6 d的淀粉粒照片。D、E、F分別是CK、CP和HP小麥淀粉粒在50 U淀粉葡萄糖苷酶于37℃處理72 h照片。白色箭頭指示被酶解成兩半的淀粉粒

表2 不同磷處理下的小麥成熟期淀粉粒經淀粉葡萄糖苷酶水解后產生的還原糖濃度

表中數據為3次重復的平均值±標準誤，不同字母代表5%水平下 差異顯著。CK：P2O50 kg·hm-2；CP：P2O5105 kg·hm-2；HP：P2O5210 kg·hm-2

Values are mean ±of three replications. Values followed by different letters within columns are signi?cantly different at＜0.05. CK: P2O50 kg·hm-2; CP: P2O5105 kg·hm-2; HP: P2O5210 kg·hm-2

2.2 小麥籽粒發育過程中淀粉合成酶與降解酶相關基因的表達

不同磷水平處理下淀粉合成與降解相關酶基因的相對表達量如圖3所示。小麥籽粒發育過程中8個淀粉合成相關酶基因和11個淀粉降解相關酶基因均有表達，但在不同磷處理下的表達模式不同。CP處理下淀粉合成與降解相關酶基因的表達量顯著高于CK和HP處理。淀粉合成相關酶基因的表達峰值主要出現在灌漿前期和中期，而淀粉降解相關酶基因的表達峰值則主要出現在籽粒灌漿的中后期。

3種磷素處理下，和的表達模式相似，花后7—28 d，CP處理下的表達量顯著高于CK和HP。與的表達模式不同，在花后14和21 d表達量較高，CP處理下花后21 d達到峰值，且顯著高于CK和HP；的表達量明顯低于，CP處理下表達量在各時期都顯著高于CK和HP，花后7 d達到峰值。3種磷處理下、、和的表達模式相似，均在籽粒發育中期表達量較高，CP處理下分別在花后21、21、14和21 d達到表達量峰值（圖3）。

如圖3所示，4個α淀粉酶基因中，和在不同磷水平下的表達模式相似，均在籽粒發育前期和中期表達量較低，在灌漿末期表達量急劇升高。的表達模式則相反，3個磷處理下都在花后7 d表達量最高。4個α淀粉酶基因中表達量最高，HP和CP處理下表達模式基本呈先下降后上升的趨勢，CP處理下花后35 d達到表達峰值，而CK條件下表達量在各時期變化不大。HP和CP處理下、、和的表達模式相似，基本呈先上升后下降的趨勢，CP處理下和分別在花后21和14 d表達量最高，和都在花后28 d表達量最高，而CK條件下這4個基因的表達量都很低。CP處理下的表達峰值出現在花后14 d，而CK和HP條件下表達量都較低。在CK和CP處理下的表達模式相同，在花后7 d表達量最高，而HP處理下則是花后28 d表達量最高。CK條件下的表達量很低，而HP和CP處理下表達較為豐富，且CP處理下花后21 d表達量最高（圖3）。

圖中數據為3次重復的平均值±標準誤，不同字母代表5%水平下差異顯著。A—K：淀粉降解酶相關基因。L—S：淀粉合成酶相關基因

Values are mean ±of three replications. Columns with different letters are signi?cantly different at＜0.05. A-K: Genes involved in starch degradation. L-S: Genes involved in starch synthesis

圖3 不同施磷水平對小麥籽粒發育過程中淀粉合成酶與降解酶相關基因的表達

Fig. 3 Relative expression of genes involved in starch synthesis and degradation in a developing wheat endosperm under different phosphorus application rates

2.3 小麥籽粒發育過程中amy4、bam1和bam5表達的空間分布

為探究不同施磷水平下小麥淀粉粒微通道結構變化和淀粉降解酶基因的表達部位之間的關系，利用原位雜交技術對降解酶基因、和進行定位（圖4和圖5）。籽粒橫切面I2-KI染色（圖4-D、H、L和D、H、L）用以表征小麥籽粒腹溝處的空腔是其固有特征，不是切片時的機械破損。原位雜交結果表明，花后7 d時、和在果種皮和早期胚乳中都有表達（圖未給出），隨著籽粒的發育，CK條件下的整個胚乳直到成熟均可以檢測到這3個基因的表達（圖-4A—C和圖5-A—C），而CP和HP處理下，花后28 d（圖4-E—G，圖4-I—K）和35 d（圖5-E—G，圖5-I—K）時這3個基因的表達主要集中于胚乳的邊緣，且這一現象在CP處理下更顯著。

CK（A—C）、CP（E—G）和HP（I—K）處理下amy4（A、E、I）、bam1（B、F、J）和bam5（C、G、K）的雜交部位呈現紅棕色的雜交信號，CK（D）、CP（H）和HP（L）處理下小麥籽粒橫切面的淀粉粒被染成藍紫色。l：糊粉層；es：胚乳：np：珠心突起；p：果種皮。切片厚度≤20 μm。下同

圖5 花后35 d小麥籽粒橫切面amy4、bam1和bam5的原位雜交和I2-KI染色（×25）

3 討論

小麥胚乳中A、B型淀粉粒的發生具有嚴格的時序性，A型淀粉粒主要出現在花后7 d左右，花后14—21 d為快速增長期；B型淀粉粒則從花后14 d左右開始出現，花后21 d左右出現直徑小于5 μm的B型淀粉粒[12]。A、B型淀粉粒的形狀和分布是受遺傳和環境因素控制的[10-11, 23]，本研究中不同磷水平下A、B型淀粉粒的基本形態未發生明顯變化，同時石河子大學農學院冬小麥課題組前期研究發現CP處理下B淀粉粒，特別是該群體中0—5 μm范圍的淀粉粒含量變化較大[18]，說明磷素對淀粉粒的分化和發育進程有重要影響。此外，石河子大學農學院冬小麥課題組發現常規施磷可顯著增加籽粒淀粉含量并可加速籽粒成熟，因此，施磷處理可能主要通過影響B淀粉粒的合成來影響總淀粉的積累量。另外，由于新疆在小麥籽粒灌漿后期干熱風頻發，合理范圍內增施磷肥促進籽粒早熟，可以在一定程度上減弱干熱風導致的籽粒減產。

微孔和微通道是小麥淀粉粒的固有特征,，且A型和B型淀粉粒微通道結構不同，其中A型淀粉粒通道較多，B型淀粉的微通道大部分被蛋白阻塞[1]。因此，可以從淀粉粒形態建成的角度解釋淀粉粒微通道結構的形成和變化的原因。Peng等[24]通過蛋白質N端測序技術和抗體免疫雜交證實小麥中分子量為150 kD的淀粉粒結合蛋白是淀粉分支酶SBE的同工型SBEIc，該酶與A、B型淀粉粒的雙向分布有關，主要和A型淀粉粒結合。Cao等[25]研究表明，小麥中A型淀粉粒的形成與較高的淀粉合成酶活性有關；通過蛋白組學分析表明，B型淀粉粒的形成可能與淀粉合成酶SSI-1的磷酸化有關。然而，由于蛋白提取方法所限，這些蛋白均未被細化為哪些是與淀粉粒微通道有關的。因此，提取小麥淀粉粒通道蛋白并對其進行鑒定和功能驗證，對解釋淀粉粒微通道的生物學起源和意義具有重要意義。

前人研究表明，AGPase在作物胚乳中對無機磷酸和3-PGA并不敏感，說明它可能受轉錄水平的調節[26]。Wang等[27]研究認為SSS、SBE和DBE可能在轉錄水平上調節淀粉的合成，而GBSSI可能在轉錄水平和轉錄后水平上調節淀粉的合成[28]。此外，Radchuk等[29]在大麥中的研究表明，籽粒發育后期的β-淀粉酶活性來源于和的表達，因此，本研究中磷處理下較高的淀粉合成與降解相關酶基因表達水平可能造成了對應酶活性的增強。

本研究中，灌漿后期籽粒的淀粉降解酶關鍵基因、和的原位雜交結果表明，CP處理下淀粉酶基因在胚乳外緣的表達量增加。與此相對應的是，通過電鏡更容易在CP處理下的淀粉粒表面和赤道凹槽部位觀察到微孔；通過激光共聚焦顯微鏡的觀察表明淀粉粒內部的微通道結構也發生了變化。此外，外源淀粉葡萄糖苷酶處理中CP條件下的淀粉粒酶解程度較高；石河子大學農學院冬小麥課題組的前期研究亦表明，發芽6 d時，CP處理下的小麥籽粒胚乳中淀粉粒降解程度和α-淀粉酶活性最高[30]，也驗證了淀粉粒內部通道結構的變化（可能是數量增多，孔徑變大），為酶解處理的淀粉粒提供了更多的降解作用位點[4]。另外，HP和CP水平下新冬23號小麥在灌漿后期籽粒α-和β-淀粉酶活性也達到最大值（數據未顯示），據此推斷磷處理下灌漿后期淀粉降解酶基因表達量的增加和降解酶活性的提高可能造成了淀粉粒微通道結構的變化。前人在玉米中的研究認為，高溫增加了淀粉粒表面的孔洞數量，推斷可能是高溫打破了淀粉合成酶和降解酶間的平衡，引起淀粉粒的自溶[9]。本研究中大部分取樣時期CP處理下籽粒淀粉合成酶和降解酶活性均顯著高于對照，推斷這兩類酶亦存在動態平衡，磷處理可能也會影響該平衡關系，造成淀粉粒表面微觀結構的變化。

小麥胚乳細胞是由胚乳外緣的分生組織分化而來，因此，較成熟的細胞分布在胚乳的中心部位，而較幼嫩的細胞分布在胚乳的邊緣[31]。CP處理下胚乳邊緣酶基因表達量較高，說明胚乳外緣的分生組織細胞保持著較旺盛的代謝活性，此部位淀粉合成與降解關鍵酶基因的轉錄水平更高。Benmoussa等[15]提出造粉體和淀粉粒的微通道可能有以下功能：（1）促進淀粉的聚合和淀粉粒的生物合成；（2）在種子萌發過程中為淀粉的降解提供反應位點[4]。基于此，CP處理下胚乳細胞造粉體微管結構可能發生了變化，增加了ADP-葡萄糖的轉運，進而促進了淀粉分子的聚合和淀粉粒的形成，這與CP處理下總淀粉含量顯著高于CK和HP（數據未顯示）以及淀粉合成相關酶基因表達量的增強是一致的。之后，隨著淀粉粒的發育，造粉體微管轉變成為微管殘體，即微通道和微孔，為淀粉的酶降解提供了反應位點[15]。另外，HP和CP處理下小麥籽粒的成熟度高于CK，可能也是造成不同磷處理間淀粉粒微觀結構和淀粉酶基因表達差異的原因。因此，要進一步探索磷處理下淀粉粒微觀結構的變化及其與淀粉合成的關系，需觀察小麥籽粒整個灌漿期淀粉粒微孔和微通道結構的動態變化。

4 結論

不同磷素供應下小麥胚乳淀粉粒形態未發生明顯改變，但是淀粉粒內部微通道結構存在差異。常規施磷條件下，小麥胚乳淀粉合成與降解相關酶基因的表達量顯著高于對照和高量施磷。常規施磷下胚乳外緣淀粉酶基因轉錄水平的提高可能影響了淀粉合成酶和降解酶之間的平衡，進而影響了淀粉粒的合成和微觀特性的變化。

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（責任編輯 李莉）

Changes of Micro-structural Characteristics of Starch Granules and the Mechanisms under Different Phosphorus Application rates in Wheat (L.)

ZHANG RunQi, FU KaiYong, LI Chao, ZU SaiChao, LI ChunYan, LI Cheng

(College of Agriculture, Shihezi University/The Key Laboratory of Oasis Eco-agriculture, Xinjiang Production and Construction Group, Shihezi 832000, Xinjiang)

Phosphorus is one of the three essential nutrients for crops. Pores and channels in starch granules play an important role in starch biosynthesis and physicochemical characteristics of wheat (L.). This study was conducted to reveal the changes of micro-structural characteristics of starch granules and the mechanisms under different phosphorus application rates in wheat. It may provide more information to improve the pathway of starch biosynthesis.Thewheat cultivar Xindong 23 was used in this study. On 160 d after sowing (about 5% plants returning green), three levels of phosphorus treatments, i.e., control (CK, P2O5, 0 kg·hm-2), conventional phosphorus (CP, P2O5, 105 kg·hm-2) and high phosphorus (HP, P2O5, 210 kg·hm-2), were applied, and the samples were collected on the 7, 14, 21, 28 and 35 days post anthesis (DPA). The micro-structural morphology of mature starch granules and the morphological changes of starch granules digested by endogenous (germination) and exogenous (amyloglucosidase) enzymes were examined using scanning electron microscopy. The concentration of reducing sugars after amyloglucosidase digestion of starches was studied, and the channel structure within starch granules was observed using confocal laser scanning microscopy. The expression patterns of the genes involved in starch biosynthesis and degradation were investigated using real-time qPCR andhybridization.The shape of the starch granules in different phosphorus treatments did not show a significant difference. However, in response to CP treatment, the “pinholes” on the granules were easier to find, and the fluorescence from the starch granules was stronger and clearly visible. At 6 days post germination (DPG), the number of “pinholes” and pits on the starch granulesin CP treatment was most abundant. After exogenous amyloglucosidase digestion, the A-type starch granules developed under CP or HP conditions were more prone to be broken into halves than those formed under CK conditions; the concentration of reducing sugars was also higher after amyloglucosidase digestion of the starch granules developed under CP or HP conditions. These data suggest dissimilar micro-structural changes of starch granules induced by different phosphorus application rates. Under conventional phosphorus application rate, the expression levels of the genes involved in starch biosynthesis and degradation were significantly higher than those under the control and high phosphorus conditions during wheat grain filling. In addition, phosphorus application promoted the transcripts of,andgenes accumulated in the peripheral cells of the endosperm, and this effect was more pronounced in CP treatment.Different phosphorus application rates did not significantly affect the shape of starch granules, but the micro-pores and channels in the starch granules and the relative expression levels of the genes involved in starch biosynthesis and degradation were significantly increased by CP application. Furthermore, CP treatment increased the transcript levels of,andthe balance between starch synthase and hydrolase activities, which may have an impact on the micro-structural characteristics of starch granules.

L.; starch granule; phosphorus; micro-structure; gene expression;hybridization

2017-04-26；

國家自然科學基金（31360334、31360292、31560389和31160256）、小麥新品種選育與種質資源創新（2016AC027）、石河子大學青年創新人才培育計劃（CXRC201703）、石河子大學新品種培育專項（YZZX201702）

接受日期：2017-06-02

聯系方式：張潤琪，E-mail：981523917@qq.com。通信作者李春艷，E-mail：lichunyan82@aliyun.com。通信作者李誠，E-mail：lichean_79@aliyun.com