食管鱗狀細胞癌患者血漿α-2-HS-糖蛋白和S100A9蛋白水平及意義

張浩亮 趙 松

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科，河南 鄭州 450052)

食管鱗狀細胞癌患者血漿α-2-HS-糖蛋白和S100A9蛋白水平及意義

張浩亮 趙 松

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科，河南 鄭州 450052)

目的評估食管鱗狀細胞癌(ESCC)血漿外泌體中表達上調的α-2-HS-糖蛋白(AHSG)和S100A9蛋白是否有潛力作為ESCC早期診斷的血漿外泌體腫瘤標志物。方法通過對46例ESCC血漿標本及46例健康對照組血漿標本差異蛋白進行Western印跡驗證，如果結果與蛋白質組學結果一致，接著再利用酶聯免疫吸附(ELISA)實驗進行大樣本的蛋白定量驗證。結果Western印跡實驗結果表明，AHSG和S100A9在ESCC患者血漿外泌體中表達量與對照組相比明顯升高。ELISA驗證結果表明，ESCC組和對照組血漿外泌體中AGSH和S100A9濃度存在顯著差異。結論兩種蛋白可以作為ESCC早期診斷的血漿外泌體腫瘤標志物，但尚需進行更大批次臨床樣本的實驗驗證，同時還需要對這兩種蛋白的特異性進行分析。

食管癌；鱗狀細胞癌；α-2-HS-糖蛋白(AHSG)；S100A9蛋白

約90%的食管癌(EC)患者病理類型屬于食管鱗狀細胞癌(ESCC)。大多數ESCC病人被發現時已經屬于腫瘤晚期。早期診斷和早期治療可獲得較好的預后效果。Western印跡通過分析著色的位置及著色深度進而獲得特定蛋白質在待分析的細胞或組織中表達情況〔1〕。酶聯免疫吸附(ELISA)實驗首先將待測物與酶進行耦聯反應，利用抗原與抗體的發生特異結合反應的屬性使酶與底物產生顯色反應，用于蛋白的定量測定〔2〕。本研究擬選取在ESCC血漿外泌體中表達上調的α-2-HS-糖蛋白(AHSG)和S100A9蛋白〔3〕，評估其是否有潛力作為ESCC早期診斷的血漿外泌體腫瘤標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 46例ESCC血漿標本均來自2015年1～5月鄭州大學第一附屬醫院胸外科住院患者，且均為患者手術時獲得，未經放化療等治療。ESCC組男26例，女20例，年齡40～60歲，TNM分期T3～T4 N0M0，病理學類型均為ESCC。46例對照組血漿標本來自2015年5月本院體檢科的健康體檢者，男26例，女20例，年齡40～60歲。本實驗經本院倫理委員會同意，且受試者知情同意。血漿處理步驟：取抗凝全血4℃，4 000 r/min離心10 min，上清即為血漿標本，分裝后凍存于-80℃冰箱中備用。

1.2主要試劑 丙烯酰胺、溴酚藍、甲叉雙丙烯酰胺、N-三羥基氨甲烷苯甲基磺酰氟、甘氨酸、二硫蘇糖醇、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉、乙二胺四乙酸等均購自Sigma公司；聚偏氟乙烯膜(PVDF)購自德國Whatman公司；EttanTM 2-D Quant Kit 試劑盒購自GE Healthcare公司。AHSG兔源性多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，羊抗兔HRP、S100A9小鼠源性單克隆抗體購自美國Abcam公司。脫脂奶粉及羊抗鼠HRP均購自美國Santa Cruz公司。檢測HRP化學發光底物的試劑盒購自Asbio Technology公司。 AHSG和S100A9 ELISA Kit、購自武漢華美生物工程有限公司。所有溶液均用超純水配制，其他試劑為國產分析純級別。

1.3主要儀器設備 電熱恒溫干燥箱購自上海躍進醫療電器廠。-80℃低溫冰箱以及恒溫搖床購自美國New Brunseick Scientific公司。電子分析天平購自德國Meilteler公司。電熱恒溫金屬水浴箱購自杭州大和熱磁電子有限公司。Hoefer Mini VE垂直電泳系統購自美國GE公司。IS2000R圖像采集工作站購自美國Kodak公司。Mimi Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell轉膜系統購自美國Bio-Rad公司。

1.4血漿標本的蛋白定量 按照Bradford蛋白定量試劑盒說明書的操作步驟測定樣本蛋白質濃度。根據待測蛋白樣品的OD值和標準曲線計算樣品中的蛋白質濃度。

1.5Western印跡檢測 隨機選取4例ESCC患者血漿標本(男女各2例)、4例健康人血漿標本(男女各2例)，分別提取血漿外泌體進行Western印跡驗證。配制12%下層膠或分離膠，配制5%上層膠或濃縮膠；取相等總蛋白量的蛋白與5倍上樣緩沖液混勻后，98℃金屬浴加熱5 min，冷卻后上樣；30 mA恒電流電泳至溴酚藍到達膠下緣約0.5 cm時，結束電泳。取出SDS-PAGE膠，將蛋白轉移至PVDF膜，所用參數設置是250 mA恒流15 min，350 mA恒流60 min；封閉使用1∶1 000稀釋比例的抗AHSG及抗S100A9抗體，4℃孵育過夜；室溫下將膜與1/5 000稀釋的HPR標記的二抗混合，孵育1 h，用ECL發光試劑盒進行顯影，利用IS2000R圖像工作站來進行WB圖像采集；PVDF膜經全自動圖像分析系統掃描后，通過條帶灰度值的變化可以間接定量分析蛋白質條帶的相對含量的變化。

1.6ELISA檢測 隨機抽取40例ESCC患者血漿(男27例，女13例)及40例健康人血漿(男22例，女18例)ELISA實驗驗證。首先分別設置空白樣品孔、標準樣品孔及待測樣品孔。按說明書進行操作。空白孔加入100 μl的樣品稀釋緩沖液，其他孔分別加入100 μl的標準品或者待檢測樣品。

1.7統計學方法 使用SPSS17.0軟件進行Levene檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1Western印跡檢測結果 AHSG在ESCC組血漿外泌體中表達量與對照組相比，呈現明顯升高，AHSG灰度值的平均值在ESCC組升高約2.9倍左右。見圖1。S100A9在ESCC組血漿外泌體中表達量與對照組相比較，呈現明顯的升高，S100A9灰度值的平均值在ESCC組升高約2.8倍，見圖1。

圖1 AHSG、S100A9蛋白Western印跡分析

2.2ELISA檢測結果 在對照組血漿外泌體中，AHSG的濃度為(70.3±2.2)μg/ml，在ESCC組血漿外泌體中濃度為(150.1±4.6)μg/ml，二者差異顯著(Plt;0.05)。S100A9在對照組血漿外泌體的濃度為(46.9±1.4)μg/ml，在ESCC組血漿外泌體中濃度為(112.5±2.9)μg/ml，兩組有顯著差異(Plt;0.05)。

3 討 論

腫瘤標志物是在腫瘤發生發展過程中能夠反映腫瘤進程的一些差異變化的分子。要確定一個分子是否可以作為腫瘤標志物，需要進行大樣本的臨床驗證，需要對該分子的可靠性、重復性和特異性等進行觀察和統計學分析，才能得出可信的結論〔4〕。隨著生命科學研究的不斷深入，研究熱點已經逐步由結構基因組學向功能基因組學發生轉移〔5，6〕。然而蛋白質組屬于功能基因組學的一個重要組成部分，廣泛應用在藥物靶標篩選、疾病的診療、疾病的發病機制的研究中，產生了一批非常有價值的研究成果〔7〕。蛋白組學技術已經在惡性腫瘤的早期檢測中找到新的分子標志物，例如，頭頸腫瘤、前列腺癌、結腸癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等，并且這些標志物具有高度的敏感性和特異性〔8～10〕。由于大部分候選腫瘤標志物的敏感度和特異性達不到要求，導致大量候選腫瘤標記物被放棄〔4〕。ESCC患者血漿外泌體相關蛋白質組學研究國內外研究相對較少，目前尚沒有應用于臨床的特異性血漿外泌體腫瘤標志物〔11〕。本研究與蛋白質組學結果一致〔3〕。進一步證實了蛋白質組學結果的可靠性，同時也提示這兩種蛋白可以作為ESCC早期診斷的血漿外泌體腫瘤標志物。但是，尚需要進行更大批次臨床樣本的實驗驗證，同時還需要對這兩種蛋白的特異性進行分析。AHSG也稱為熱穩定性糖蛋白，胎兒期的多種組織均能合成此蛋白，然而對于成年人來說，該蛋白主要是由肝臟合成，AHSG屬于骨基質的一種重要組成成分，半衰期為4～5 d〔12，13〕。多項研究表明，AHSG是一個多功能性蛋白，在多種癌癥血漿中的表達水平不同〔12～15〕。同時，它也是一種負急性時相反應蛋白，在惡性腫瘤、感染、大手術后或者營養不良時，血清AHSG水平明顯下降。另外，AHSG還參與骨代謝調節、血管鈣化、胰島素抵抗、蛋白酶活性調控、角質形成細胞遷移及乳腺腫瘤細胞增殖的信號轉導等病理生理過程，是一種神經退行性疾病的生物標志物〔16〕。有報道表明，AHSG可能是通過阻斷TGF-β信號轉導來抑制腸道腫瘤的進展〔17〕。然而，本研究結果表明，在ESCC患者血漿外泌體中發現AHSG的表達上調，與以往癌癥血漿中AHSG表達下調相比較而言，AHSG在血漿外泌體的表達量與血漿種AHSG的水平不太一致。推測AHSG蛋白有可能會成為與ESCC密切相關的特異性血漿外泌體腫瘤標志物。

S100A9是一種鈣離子結合蛋白，常以同源二聚體的形式存在，或者與S100A8形成異源二聚體，具有EF手型結構〔18〕。S100A9是一種高豐度的脊髓源性質漿蛋白，表達S100A8/A9的巨噬細胞能夠被募集到很多癌癥的炎癥部位，例如，胰腺癌、胃癌、小細胞肺癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等〔19〕。S100A9在細胞膜上的受體是Toll樣受體4和RAGE，其介導的細胞信號轉導在炎癥的級聯信號放大中扮演重要角色〔20〕。亞硝酰基化的S100A9能夠降低炎癥的反應程度，并且S100A9還能調控著骨髓細胞的成熟〔21〕。另外，S100A9在很多癌癥中表達上調〔22〕。本實驗結果表明，在ESCC組血漿外泌體中表達明顯上調，S100A9可能是一個ESCC潛在的血漿外泌體腫瘤標志物。

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〔2017-01-10修回〕

(編輯 李相軍)

R655.4

A

1005-9202(2017)21-5351-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.060

趙 松(1963-)，男，教授，主任醫師，博士生導師，主要從事胸部疾病研究。

張浩亮(1981-)，男，主治醫師，主要從事胸部疾病研究。