核因子-κB激活調控蛋白PRDX4在腦膜瘤組織中的表達及其臨床意義

葉富躍 楊 堃 王子珍 馬春陽 陳政剛 吳 然 周 健 王 艷

(海南醫學院第一附屬醫院神經外科，海南 海口 571199)

核因子-κB激活調控蛋白PRDX4在腦膜瘤組織中的表達及其臨床意義

葉富躍 楊 堃 王子珍 馬春陽 陳政剛 吳 然 周 健 王 艷

(海南醫學院第一附屬醫院神經外科，海南 ?？?571199)

目的探討腦膜瘤組織中PRDX4的表達差異及其與臨床病理的相關性。方法采用Western印跡和免疫組化(SP法)分析68例腦膜瘤組織、59例配對的瘤旁腦膜組織及45例正常腦膜組織中PRDX4的表達情況，并分析腦膜瘤組織中PRDX4與核因子(NF)-κB活化產物p65的相關性，進一步應用分層分析、生存分析和Cox多元回歸分析腦膜瘤患者PRDX4的表達與臨床病理及其預后的關系。結果腦膜瘤組織PRDX4蛋白條帶灰度值較瘤旁和正常腦膜組織顯著增高(Plt;0.001)，且瘤旁腦膜組織PRDX4蛋白表達較正常腦膜組織高(Plt;0.05)；腦膜瘤PRDX4與NF-κB p65蛋白表達具有顯著正相關性(Plt;0.05)；且腦膜瘤患者中PRDX4陽性表達與臨床分期有顯著相關性(Plt;0.01)；進一步生存分析發現PRDX4表達陽性者5年無瘤生存期和生存率顯著低于陰性者(Plt;0.05)，且Cox分析示PRDX4可能是腦膜瘤患者5年無瘤生存預后的獨立影響因素(Plt;0.05；RR=1.484；95%CI：1.077～2.260)。結論NF-κB激活調控蛋白PRDX4可能為早期診斷腦膜瘤的生物學標志，且與腦腫瘤臨床分期密切相關，可能具有獨立預測腦膜瘤患者5年無瘤生存預后的重要臨床價值。

PRDX4；腦膜瘤；早期診斷；預后

核因子(NF)-κB作為調節基因轉錄的關鍵因子之一，可能在多種腫瘤發生、發展或進展過程中起重要生物學作用〔1〕。腦膜瘤是顱內最為常見的良性腫瘤，但如果未能及時發現或未得到有效控制，同樣會有預后惡化風險〔2〕。隨著腦膜瘤分子生物學研究的不斷進展，其發生發展分子機制也不斷被人們所揭示，但尚待進一步探索具有重要臨床意義的分子水平研究〔3〕。PRDX-4蛋白由PRDX4基因編碼，為一種抗氧化物酶，主要存在于細胞質中，有效還原過氧化氫或烷基氫過氧化物使其變成水和乙醇。目前已有研究表明PRDX4可調控NF-κB的激活進而可能參與生物學過程〔4〕。本研究通過對腦膜瘤相關臨床組織標本進行PRDX4和NF-κB p65的綜合性分析，進而揭示可能的其在患者臨床病理及其預后方面的重要臨床意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取海南醫學院第一附屬醫院2008年11月至2013年4月接受顱內腫瘤摘除術的68例患者，均經外檢病理學及臨床相關資料確診為腦膜瘤，給予個體化手術和(或)輔助治療；同時成功收集配對的腦膜瘤瘤旁組織59例，同期顱腦外傷患者的正常腦膜組織45例為正常組(男20例，女25例)，每例的組織樣本均為兩份(用于Western印跡和免疫組化分析)。腦膜瘤患者的KPS評分均60～80分。正常組≥60歲21例，lt;60歲24例；且3組平均年齡分別為(59.1±10.9)歲、(57.2±11.5)歲和(54.9±14.8)歲，差異均無統計學意義(Pgt;0.05)?；颊呔橥獠⒔洷驹簜惱砦瘑T會批準，人口統計學和臨床病理等基線資料見表1。

表1 兩組臨床病理參數(n)

1.2Western印跡檢測 將術中獲得的腦膜瘤、瘤旁或腦膜組織在液氮中充分研磨，SDS蛋白裂解液處理后得到的上清液移入EP管中。制作蛋白濃度標準曲線并分析得到不同樣本的蛋白濃度，根據目的蛋白分子量按需配制PAGE膠，將玻璃板固定于垂直電泳槽中，將蛋白樣品濃度調至一致后等量加入點樣孔，待溴酚藍指示線跑至膠底部時終止電泳；甲醇浸泡預處理PVDF膜1～2 min，從底層依次黑色板-海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-白色板組裝三明治結構并放入轉膜儀中，電壓100 V和100 min后終止轉膜；將膜放于TBST液中清洗2～3次，TBST配制的5%脫脂牛奶封閉處理膜(搖床1 h)，后加入一抗孵育(β-actin 1∶1 000購于聯科生物有限公司；PRDX4 1∶1 000和NF-κB p65 1∶1 000均購于CST公司)，搖床4℃過夜，TBST液搖床漂洗3次，每次10 min，再加入適量5%脫脂牛奶和二抗混勻孵育，室溫1 h，TBST液搖床漂洗3～5次，每次10 min，最后取顯影液A和B按1∶1比例適量混勻加于膜上，并立即采用凝膠圖像分析儀進行曝光和圖像保存。采用image pro-plus軟件對目的蛋白條帶進行灰度值分析。

1.3免疫組化(SP法)檢測 免疫組化PRDX4單克隆抗體購于Abcam公司；SP法免疫組化試劑盒購于中杉金橋公司。將三組不同臨床樣本經甲醛固定、脫水、包埋和切片后，再經二甲苯脫蠟和乙醇透明，三蒸水和磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3～5次后滴加甲醇H2O2室溫10 min以消除內源性過氧化酶，高壓抗原修復(0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液)處理20 min后自然冷卻，PBS漂洗3次后滴加免疫組化封閉液室溫孵育20 min，甩去并滴加一抗(PRDX4 1∶500)放于4℃過夜，PBS漂洗3次后滴加二抗37℃孵育60 min，漂洗3次后滴加SP復合物37℃孵育30 min，PBS漂洗3次后DAB顯色，自來水終止染色，蘇木素復染，脫水、透明和封片。陰性對照采用PBS代替一抗，陽性對照則用陽性組織片。

1.4免疫組化結果評定 PRDX4蛋白表達定位于細胞質中，按細胞染色強度進行評定得分：無著色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。按陽性染色百分比：陰性0分；陽性細胞數≤10%1分；gt;10%且lt;51%2分；≥51%且≤75%3分；gt;75%4分。最后按染色強度得分和陽性染色百分比得分的乘積結果分4個等級：“-”，0～2分；“+”，3～5分；“”，6～8分；“”，9～12分；其中≥3分均為陽性。

1.5隨訪 腦膜瘤患者先后進行了為期5年的臨床預后監測，主要觀察內容是術后和(或)輔助治療后5年無瘤不良事件發生情況(包括復發、轉移或死亡)，并記為生存終點事件，以分析患者5年無瘤生存，主要采用門診隨訪方式進行，隨訪過程中無失訪者出現，隨訪率達100%。

1.6統計學方法 采用SPSS11.5軟件進行t檢驗或秩和檢驗、χ2檢驗，臨床參數資料與無瘤生存的歸因分析采用Cox生存風險模型方法；Kaplan-Meier壽命表法分析無瘤生存并繪制生存曲線，組間比較用Log-rank檢驗；采用Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1腦膜瘤組織PRDX4表達差異 腦膜瘤組織中PRDX4蛋白表達條帶灰度為(165.14±40.77)，蛋白陽性表達率為75.0%(51/68)，較瘤旁腦膜和正常腦膜組織〔(96.23±26.45)、(46.11±20.89)和44.1%(26/59)、22.2%(10/45)〕均顯著增高(均Plt;0.001)，瘤旁腦膜組織中PRDX4表達和陽性率也顯著高于正常腦膜組織(P=0.000，0.020)。

2.2腦膜瘤PRDX4與NF-κB p65的蛋白表達 NF-κB p65蛋白表達：腦膜瘤組(244.39±69.40)gt;瘤旁組(171.51±45.11)gt;正常組(90.87±39.22)；PRDX4蛋白表達：腦膜瘤組(165.14±40.77)gt;瘤旁組(96.23±26.45)gt;正常組(46.11±20.89)差異有統計學意義(Plt;0.001)；且PRDX4和NF-κB p65的蛋白表達呈顯著性正相關(腦膜瘤組、瘤旁組及正常組分別為r=0.623，0.522，0.513，均Plt;0.05)。

2.3腦膜瘤PRDX4與臨床病理參數的分層比較 僅腦膜瘤臨床分期與PRDX4表達密切相關(P=0.002)，見表2。

2.4腦膜瘤PRDX4與臨床預后 (1)Kaplan-Meier生存分析發現PRDX4陽性表達者的5年無瘤生存期和生存率分別為(48.1±2.3)個月和60.8%，明顯低于PRDX4陰性者的(58.3±1.4)個月和88.2%，經Logrank檢驗，差異有統計學意義(P=0.036，lt;0.05)，見圖1。(2)COX分析發現PRDX4蛋白表達水平與腦膜瘤患者5年無瘤生存密切相關(P=0.049；RR=1.484；95%CI：1.002～2.197)，見表3。

表2 腦膜瘤患者PRDX4蛋白表達與臨床病理參數相關性分析(n)

圖1 PRDX4陽性者和陰性者的5年無瘤生存曲線比較

因素回歸系數標準誤差Waldχ2值P值RR(95%CI)年齡-0.449-1.1570.1510.6980.638(6.156～0.066)性別-0.023-0.0360.4190.5170.977(1.048～0.911)病理類型-0.879-1.2180.5210.4700.415(4.521～0.038)WHO分級0.2270.1951.3550.2441.255(0.856～1.840)腫瘤繼發變化-0.691-0.8530.6570.4180.501(2.665～0.094)腦腫瘤分期0.1790.1152.4320.1191.196(0.955～1.498)PRDX40.3950.2003.8890.0491.484(1.002～2.197)

3 討 論

NF-κB又稱為κ基因結合核因子(NF)-κB，機體多種激酶、細胞因子和早期反應蛋白基因啟動子均包含其結合部位，進而可能促進基因轉錄，參與機體炎癥、免疫反應、細胞增殖和凋亡等多種調控過程〔5〕。NF-κB/Rel家族由ReLA(P65)、RelB、C-Rel、V-Rel、NF-κB1(P50/P105)、NF-κB2(P52/P100)等組成，不同結合形成不同轉錄因子。目前已經證實NF-κB在乳腺癌、大腸癌中表達明顯增高，且與肝癌、白血病和淋巴瘤等的發生相關。有報道顯示NF-κB在腦膜瘤組織中存在過度表達〔6，7〕，且可能通過其抗細胞凋亡和直接促進細胞增殖的作用形成腫瘤生長〔8〕，尤為重要的是某些致癌基因也可通過NF-κB的分子信號通路介導腦膜瘤的發生發展〔9〕。

近年來，有研究發現某些特異性蛋白質組或蛋白表達方式可用于區分腦部腫瘤的不同亞型或等級〔10〕。腦膜瘤是顱內腫瘤發病率最高的腫瘤之一，因其有惡性轉化可能常影響患者生存預后，是目前腦部腫瘤的研究熱點之一。崔廣強等〔11〕通過蛋白質組學方法分析發現了包括PRDX4蛋白在內的4種蛋白在腦膜瘤組織中表達明顯上調，但尚缺乏進一步臨床相關性分析探討其生物學作用和臨床指導意義。目前有研究提示，PRDX4可能調控了NF-κB的激活進而可能參與腦膜瘤的發生發展過程〔4〕。本研究結果表明PRDX4可能作為致癌基因參與了腦膜瘤的發生，PRDX4基因可能作為一種生物學標志物具有早期診斷腦膜瘤的臨床預測意義。而且PRDX4可能參與了NF-κB信號通路，進而參與了腦膜瘤發生發展進程，但由于本研究未能分析NF-κB家族其他蛋白的表達及與NF-κB信號通路激活相關關系，因此尚待進一步深入研究二者間的直接互作或間接作用關系。另外本研究結果提示，PRDX4可能成為腦膜瘤的獨立預后影響因素，具有重要的臨床預測意義，但尚待多中心、大樣本臨床研究證實。

1Vlahopoulos SA，Cen O，Hengen N，etal.Dynamic aberrant NF-κB spurs tumorigenesis：A new model encompassing the microenvironment〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2015；26(4)：389-403.

2Whittle IR，Smith C，Navoo P，etal.Meningiomas〔J〕.Lancet，2004；363(9420)：1535-43.

3Wrobel G，Roerig P，Kokocinski F，etal.Microarray-based gene expression profiling of benign，atypical and anaplastic meningiomas identifies novel genes associated with meningioma progression〔J〕.Int J Cancer，2005；114(2)：249-56.

4Zhang Y，Emmanuel N，Kamboj G，etal.PRDX4，a member of the peroxiredoxin family，is fused to AML1 (RUNX1) in an acute myeloid leukemia patient with a t(X；21)(p22；q22)〔J〕.Genes Chromosomes Cancer，2004；40(4)：365-70.

5Karin M.Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression〔J〕.Nature，2006；441(7092)：431-6.

6夏祥國，劉增進，王 丹，等.核因子-κB與腦膜瘤細胞增殖的關系〔J〕.現代預防醫學，2008；35(16)：3208-13.

7夏祥國，支興剛，陳禮剛，等.核因子-κB在腦膜瘤組織中的表達及意義〔J〕.中國臨床神經科學，2005；13(2)：156-60.

8潘 雷，王英華，曾錦旗，等.核轉錄因子NF-κB的研究進展〔J〕.現代實用醫學，2002；14(4)：205-7.

9Ammoun S，Provenzano L，Zhou L，etal.Axl/Gas6/NFκB signalling in schwannoma pathological proliferation，adhesion and survival 〔J〕.Oncogene，2014；33(3)：336-46.

10Vankalakunti M，Vasishta RK，Das Radotra B，etal.MIB-1 immunolabeling：a valuable marker in prediction of benign recurring meningiomas〔J〕.Neuropathology，2007；27(5)：407-12.

11崔廣強，矯愛紅，劉愛娜，等.HSD17B10、ALDH9A1、ALDH2、PRDX4在腦膜瘤蛋白質組學中的上調表達〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(2)：441-3.

〔2017-03-11修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)

R73

A

1005-9202(2017)21-5331-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.051

海南省社會發展科技專項基金(SF201407)

葉富躍(1983-)，男，主治醫師，主要從事神經腫瘤及顱腦損傷研究。