甘精胰島素對初診2型糖尿病Nrf2-Keap1-ARE信號通路的影響

陳傳綺 羅千軍 鄢燕瓊 鐘曉紅

(中南大學湘雅二醫院深圳醫院，廣東 深圳 518067)

甘精胰島素對初診2型糖尿病Nrf2-Keap1-ARE信號通路的影響

陳傳綺 羅千軍 鄢燕瓊 鐘曉紅

(中南大學湘雅二醫院深圳醫院，廣東 深圳 518067)

目的探討甘精胰島素對初診2型糖尿病(T2DM)患者核因子E2相關因子2-kelch樣ECH連接蛋白1-抗氧化反應元件(Nrf2-Keap1-ARE)信號通路的影響。方法將50例糖尿病患者作為實驗組，并且每晚睡前皮下注射甘精胰島素；同時選取年齡、性別相匹配的健康者50人為對照組。收集所有人血液，檢測血液生化指標：空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)；酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測甘精胰島素治療前后及對照組Nrf2、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、血紅素單加氧酶(HO)-1和醌氧化還原酶〔NAD(P)H：NQO1〕含量。結果與對照組相比，實驗組治療前FPG、TC、TG、LDL-C和HbA1c顯著升高(Plt;0.05)，實驗組治療后較本組治療前FPG、TC、TG、LDL-C和HbA1c顯著下降(Plt;0.05)；實驗組治療前SOD與GST水平明顯低于對照組(Plt;0.05)，Nrf2、HO-1和NQO1顯著高于對照組(Plt;0.05)；實驗組治療后較本組治療前SOD與GST水平增加，Nrf2、HO-1與NQO1水平顯著減少(Plt;0.05)。結論糖尿病時Nrf2表達升高，其靶基因下游蛋白HO-1和NQO1也隨之上升。甘精胰島素通過抑制 Nrf2-Keap1-ARE信號通路改善胰島素抵抗，其機制可能與改善氧化應激狀態有關，該信號通路可能成為治療T2DM的潛在靶點。

甘精胰島素；2型糖尿病；Nrf2/Keap

目前糖尿病(DM)有年輕化的趨勢〔1〕，且往往導致心血管并發癥〔2〕。研究表明DM與氧化應激有著密切的聯系〔3〕。核因子E2相關因子2-kelch樣ECH連接蛋白(Keap)1-抗氧化反應元件(Nrf2-Keap1-ARE)信號通路是近年來抗氧化研究領域的熱點〔4〕。大部分DM患者是以胰島素抵抗(IR)和胰島β細胞衰竭為主的2型糖尿病(T2DM)〔5〕，對口服降血糖藥物控制不好的T2DM患者首選胰島素治療。本文旨在探討甘精胰島素對T2DM患者Nrf2-Keap1-ARE信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料 實驗組：收集2014年6月至 2016年6月在中南大學湘雅二醫院深圳醫院糖尿病中心門診和住院部初診的T2DM患者50例，其中男29例，女21例；年齡58～72〔平均(65.4±5.9)〕歲；病程2～11年，平均(6.6±2.4)年；所有患者符合世界衛生組織(WHO)DM診斷標準(1999年)，入院前未口服降血糖藥與胰島素治療，并且未出現嚴重DM并發癥與嚴重腦、心、肝、腎疾病。對照組：在本院體檢中心另選年齡相匹配的健康者50人，其中男26人，女 24人，年齡54～67〔平均(64.2±4.1)歲〕。兩組一般資料無統計學差異(Pgt;0.05)，具有可比性。

1.2檢測指標及方法 (1)臨床生化指標檢查：治療前后收集兩組血液10 ml，測定空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和糖化血紅蛋白(HbA1c)。其中，DM患者每晚注射一次甘精胰島素控制血糖，劑量根據體重計算并根據血糖情況調整。(2)酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測：以雙抗夾心ELISA檢測兩組血清中Nrf2及抗氧化酶水平：谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、血紅素單加氧酶(HO)-1，醌氧化還原酶(NAD(P)H:NQO1)。

1.3血清樣品準備 抽取患者靜脈血標本5 ml，12 000 r/min離心25 min，吸取上清后，分裝，保存于-70℃；將倍比稀釋的標準品各100 μl依次加入1排7孔中，另一孔只加樣品稀釋液作為對照；待測樣品均用樣品稀釋液作2倍稀釋，100 μl/孔依次加入酶標包被板中，37℃孵育90 min；反應后洗板3次，加入生物素抗體工作液(100 μl/孔)，37℃孵育60 min；洗板3次，加入酶結合物親和素-過氧化物酶復合物(ABC)工作液(100 μl/孔，除空白孔外)，37℃孵育30 min；洗板5次，加入TMB顯色工作液(100 μl/孔，包括空白孔)，37℃避光孵育；當標準品前3～4個孔有明顯的梯度藍色時加入TMB終止液100 μl/孔；用酶標儀在450 nm處測定吸光度(A)值(10 min內)。根據標準品孔對應的A值和相應的標準濃度繪制標準曲線。根據樣品的A值在坐標上找出相對應的濃度，乘以稀釋倍數(2倍)即為待測樣品的終濃度。

1.4統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行t檢驗或單因素方差分析。

2 結 果

2.1兩組治療前后生化指標比較 治療前實驗組TG、TC、LDL-C與HbA1c、FPG水平明顯高于對照組(Plt;0.05，Plt;0.01)；HDL-C水平無明顯統計學差異(Pgt;0.05)。實驗組治療后與治療前相比，FPG、TG、TC、LDL-C以及HbA1c水平顯著下降(Plt;0.05)，HDL-C水平無統計學差異(Pgt;0.05)。見表1。

2.2兩組ELISA檢測結果比較 治療前實驗組SOD與GST水平明顯低于對照組，Nrf2、HO-1和NQO1水平顯著高于對照組(均Plt;0.05)；實驗組SOD、GST，Nrf2、HO-1和NQO1在治療后明顯改善，但仍與對照組有顯著差異(Plt;0.05)。實驗組治療后與治療前相比，SOD與GST水平顯著增加，Nrf2、HO-1與NQO1水平顯著減少(Plt;0.05)。見表2。

表1 兩組血清生化指標比較

1)實驗組治療前與治療后比較；2)實驗組治療前與對照組比較；3)實驗組治療后與對照組比較；下表同

表2 兩組Nrf2、GST、SOD、HO-1和NQO1水平比較

3 討 論

Nrf2是亮氨酸拉鏈轉錄因子，并且調節內源性以及外源性親電性和氧化應激〔6〕。在非應激條件下，Nrf2與Keap1在漿膜結合。在漿膜中，Keap1促進Ntf2蛋白酶體降解通過Cul/Rbx E3配基系統〔7〕。一旦接觸應激或者化學誘導劑(三萜類、異硫氰酸酯等)，Keap1的半胱氨酸被修飾導致Keap1/Nrf2復合物降解，避免Nrf2蛋白酶體降解，致Nrf2聚集進而轉入核內，在核內結合ARE的調節靶基因的區域，從而誘導轉錄。經典的Nrf2靶基因包括GST調控位點，NQO1在抗氧化反應中發揮著重要的作用〔8〕。HO-1屬于熱休克蛋白家族，同時也是Nrf2調節的下游，是血紅素代謝的限速酶，在氧化應激狀態下增高，具有抗氧化的作用〔9〕。甘精胰島素是一種長效胰島素，使用DNA重組技術制備的胰島素類似物〔10〕。經皮下注射可以緩慢吸收，有效作用可以達到24 h，能夠很好地模擬內源性胰島素分泌，有效控制血糖還能夠減少夜間低血糖發生〔11〕。老人應用會更加安全。甘精胰島素除具有降糖作用外,還有顯著的抗感染效果,能改善IR、保護胰島β細胞以及顯著的抗動脈粥樣硬化作用,并減少氧自由基對靶器官的損害〔12〕。甘精胰島素可以通過調整抗氧化酶的濃度抑制氧化應激,也可能通過抑制NADPH氧化酶的表達直接抑制脂質過氧化。

研究發現，使用胰島素對T2DM患者進行降糖治療,隨著時間推移可以降低氧化應激。本研究結果表明甘精胰島素可以升高氧化應激誘導的內源性SOD和GST抗氧化酶的降低，從而減少全身炎癥反應。表明DM時發生氧化應激，刺激Nrf2與它的分子伴侶蛋白Keap1解離，進入核內結合ARE，從而刺激HO-1和NQO1表達。當使用甘精胰島素治療，氧化應激減少，與治療前Nrf2、NQO1和HO-1相比，治療后表達顯著降低。

Nrf2在活性氧環境中保護胰島β細胞〔13〕。本研究發現，DM時Nrf2表達升高，其靶基因下游的蛋白HO-1和NQO1也隨之上升，可能與提高抗氧化應激能力有關，Nrf2活化劑和Keap1抑制劑可能成為治療T2DM新的策略。總之，甘精胰島素通過抑制 Nrf2-Keap1-ARE信號通路改善IR，其機制可能與改善氧化應激狀態有關，該信號通路可能成為治療T2DM的潛在靶點。

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12劉頤軒，宋 桉，王 蕓，等.氧化應激在肥胖及胰島素抵抗中的作用研究進展〔J〕.解放軍醫藥雜志,2014;26(1):99-101.

13趙 麗.Nrf2/HO-1途徑對高脂飲食誘導的大鼠胰島素抵抗的保護作用和機制研究〔D〕.西安：第四軍醫大學,2012.

〔2017-01-09修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R587.1

A

1005-9202(2017)21-5285-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.029

深圳市科技創新委基金課題 (No.JCYJ20160428101710597)

陳傳綺(1969-)，女，副主任醫師，碩士，主要從事內分泌及代謝疾病研究。