Parkin基因表達對過氧化氫致線粒體損傷的保護作用

常春艷 平鋒鋒 洪善超 王曉明

(無錫市人民醫院臨床研究中心，江蘇 無錫 214194)

Parkin基因表達對過氧化氫致線粒體損傷的保護作用

常春艷 平鋒鋒 洪善超1王曉明2

(無錫市人民醫院臨床研究中心，江蘇 無錫 214194)

目的探討Parkin對過氧化氫(H2O2)引起的氧化應激反應中線粒體穩態的調節機制。方法應用Western印跡檢測H2O2損傷的SH-SY5Y細胞不同時間內源Parkin的表達；構建pcDNA 3.1Parkin WT質粒，并轉染Hela細胞；應用流式細胞儀檢測JC-1染色，并計算線粒體膜電位變化；應用RT-PCR技術檢測線粒體促分裂因子hfis1 mRNA水平。結果在H2O2損傷3、6 h的SH-SY5Y細胞中Parkin蛋白水平升高，Hela細胞中，Parkin蛋白的表達可以抑制H2O2引起的線粒體膜電位降低，促進線粒體分裂因子hfis1 mRNA的增加。結論Parkin參與細胞的氧化應激反應，其蛋白的表達可以抑制H2O2引起的線粒體異常，維持線粒體穩態。

Parkin；帕金森病；線粒體穩態

帕金森病(PD)是最常見的慢性神經系統退行性病變之一。迄今為止已經克隆或在染色體上定位了三個常染色體隱性PD相關基因〔1〕，Parkin(PARK2)突變最常見〔2〕，該基因編碼的蛋白具有泛素E3連接酶活性，除了通過泛素蛋白酶體系統參與底物降解，Parkin還在信號傳導、DNA修復、氧化應激和線粒體穩態等多方面發揮重要作用〔3，4〕。目前研究顯示遺傳因素和氧化應激均可引起線粒體功能失調并參與PD發生〔4，5〕。Parkin參與線粒體穩態調節的機制仍不明確，本實驗探討Parkin對過氧化氫(H2O2)引起的氧化應激反應中線粒體穩態的調節機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 SH-SY5Y細胞系購自中科院細胞所；Hela細胞為本實驗室保存。pcDNA 3.1-myc-his(-)A載體購自Invitrogen公司；E.Coli-DH5α為本實驗室保存。限制性內切酶HindⅢ 和BamHⅠ(Fermentas公司)，兔抗-GAPDH(Sigma)，鼠抗Parkin(Cell Signal)，辣根過氧化物酶(HRP)抗鼠、抗兔IgG(上海鈺森生物)，JC-1/線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)，逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)，qPCR Master Mix (BIONEER公司)。CO2培養箱購自德國Heraeus公司，Heal Force生物安全柜購自上海力申科學儀器有限公司，免疫印跡的全套設備和MiniOpticonTMRT-PCR檢測系統購自美國Bio-Rad公司，流式細胞儀FACSCanto Ⅱ購自美國BD公司。

1.2細胞培養 神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，宮頸癌細胞Hela細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.3重組質粒pcDNA3.1(-) Parkin WT構建 設計并合成的Parkin引物序列為：正義鏈5′CCGGAATTCGCCACCATGATAGTGTTTGTCAGGTTC3′，反義鏈5′CGCGGATCCCACGTCGAACCAGTGGTCC3′，在引物中引入EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切酶切位點，用此引物從cDNA文庫中克隆全長Parkin基因片段，經雙酶切后連入pcDNA3.1(-)載體中，連接產物轉化至DH5α大腸桿菌感受態細胞中，涂布于含氨芐西林的LB平板培養基上，挑選陽性菌落進行菌落PCR檢測，提質粒進行雙酶切初步鑒定，篩選出的陽性菌株送上海美吉生物公司測序。測序結果與GenBank中源基因比對，確定序列正確無誤。

1.4蛋白提取及Western印跡檢測 將SH-SY5Y細胞接種于60 mm培養皿中，培養至匯合度達到70%后，加入100 μmol/L H2O2分別處理0，3，6，12 h。收集細胞并加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解細胞，收集裂解液并加入5倍上樣緩沖液，沸水浴10 min熱變性蛋白。根據目的蛋白分子量配制10%分離膠和5%濃縮膠，將蛋白樣品和蛋白Marker 加入上樣孔內。電泳后半干法將蛋白轉到PVDF膜上，然后將PVDF膜浸泡于5%脫脂奶粉Tris鹽酸緩沖溶液(TBS)中，室溫搖晃封閉1 h；一抗中室溫搖晃2 h或者4℃孵育過夜，GAPDH和Parkin的稀釋比例分別為1∶10 000和1∶1 000；二抗室溫孵育1 h，化學發光液處理后于暗室顯影。

1.5線粒體膜電位檢測 取對數生長期的Hela細胞，以5×104個/cm2的密度接種于24孔板過夜。加入JC-1熒光染料(終濃度50 μmol/L)繼續37℃孵育30 min，DMEM洗細胞三遍。4℃離心3～4 min，沉淀細胞。然后JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。再用100 μl JC-1染色緩沖液(1×)重懸后，流式細胞儀分析。紅光激發光波長579 nm，最大發射波長599 nm，綠光激發光波長490 nm，最大發射波長516 nm，實驗重復三次。

1.6PCR引物設計 根據GenBank中的基因序列設計RT-PCR引物，由上海生工合成。GAPDH 的擴增引物：上游引物5′-TTGCCATCAATGACCCCTTCA-3′；下游引物5′-CGCCCCACTTGATTTTGGA-3′；hfis1擴增引物：上游引物5′-AAAGGGAGCAAGGAGGAACA-3′；下游引物5′-TGGGGCTCTGTCTGCAGCAA-3′。

1.7RT-PCR法檢測hfis1 mRNA表達 Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA，然后加入目的基因引物進行PCR擴增，94℃預變性10 min，94℃變性20 s，55℃退火35 s，共計35個循環，4℃終止反應。擴增結束后，根據設定的閾值獲得 Ct 值并計算出相對的目的基因表達量=2-△△Ct。

1.8統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1重組pcDNA3.1(-) Parkin WT表達載體鑒定 重組后的質粒經雙酶切和菌落PCR法鑒定，結果為陽性的菌株送上海美吉公司測序，測序結果經Blast與GenBank中源基因比對，序列完全正確。

2.2H2O2處理的SH-SY5Y細胞中內源性Parkin蛋白的表達 Western印跡(圖1)檢測顯示，3 h組(2.697±0.401)和6 h組(1.697±0.327)Parkin蛋白明顯高于0 h組(1.055±0.347)(Plt;0.05)，12 h組(1.355±0.426)與0 h組無統計學差異(Pgt;0.05)。

圖1 100 μmol/L H2O2處理不同時間對內源性Parkin表達的影響

2.3線粒體膜電位變化 H2O2處理組相對熒光比值(221.597±69.210)明顯高于對照組(104.257±25.381)和過表達Parkin的H2O2處理組(137.697±34.526)(Plt;0.05)；對照組和過表達Parkin的H2O2處理組間無統計學差異(Pgt;0.05)。

2.4hfis1 mRNA表達 H2O2處理組中hfis1 mRNA水平(130.137±4.385)明顯高于對照組(102.107±3.255)和過表達Parkin的H2O2處理組(57.184±4.252，Plt;0.05)；對照組hfis1 mRNA水平低于過表達Parkin的H2O2處理組(Plt;0.05)。

3 討 論

H2O2損傷可以使線粒體及細胞內蛋白質、脂類及核酸的氧化，最終導致線粒體功能下降。線粒體能量合成出現障礙，進一步造成細胞內外離子失衡和膜電位下降，引起線粒體內膜通透性改變。誘發細胞色素(Cyt)C從線粒體釋放到細胞質中。Cyt C可以與凋亡激活因子-1及pro-caspase-9 形成凋亡小體，活化Caspase途徑，進一步導致線粒體膜破裂，從而引發神經細胞凋亡〔6〕。本研究結果提示Parkin可能參與H2O2細胞應激過程。這一結果與之前的研究發現氧化應激時Parkin轉錄促進子活性增強，特異性激活Parkin轉錄，從而其蛋白水平上升相一致〔7〕。Parkin蛋白還可以作為泛素E3連接酶，通過泛素一蛋白水解酶系統其底物及自身蛋白泛素化，阻止氧化損傷蛋白的毒性聚集，可有效清除細胞內垃圾蛋白積累產生的細胞毒性〔3〕。這可以解釋我們在無內源Parkin表達的Hela細胞中外源引入Parkin質粒并表達該蛋白后發現，Parkin蛋白的表達可以抑制過氧化氫引起的線粒體膜電位降低和促線粒體分裂蛋白hfis1 mRNA的增加。本研究提示，Parkin蛋白可以通過調節hfis1基因轉錄參與應對氧化應激損傷并維持線粒體穩態。然而，Parkin對Hfis1的更深入調節機制仍需要進一步的實驗驗證。

1Bekris LM，Mata IF，Zabetian CP.The genetics of Parkinson disease〔J〕.J Geriatr Psychiatry Neurol，2010；23(4)：228-42.

2Rakovic A，Grunewald A，Seibler P，etal.Effect of endogenous mutant and wild-type PINK1 on Parkin in fibroblasts from Parkinson disease patients〔J〕.Hum Mol Genet，2010；19(16)：3124-37.

3Kubli DA，Quinsay MN，Gustafsson AB.Parkin deficiency results in accumulation of abnormal mitochondria in aging myocytes〔J〕.Commun Integr Biol，2013；6(4)：e24511.

4Cookson MR.Parkinsonism due to mutations in PINK1，parkin，and DJ-1 and oxidative stress and mitochondrial pathways〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Med，2012；2(9)：a9415.

5Seet RC，Lee CY，Lim EC，etal.Oxidative damage in Parkinson disease：measurement using accurate biomarkers〔J〕.Free Radic Biol Med，2010；48(4)：560-6.

6Perl A，Nagy G，Gergely P，etal.Apoptosis and mitochondrial dysfunction in lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus〔J〕.Methods Mol Med，2004；102：87-114.

7Tan EK，Puong KY，Chan DK，etal.Impaired transcriptional upregulation of Parkin promoter variant under oxidative stress and proteasomal inhibition：clinical association〔J〕.Hum Genet，2005；118(3-4)：484-8.

〔2016-10-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R742.5

A

1005-9202(2017)21-5273-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.024

無錫市人民醫院一研一題基金項目(No.TY201307)

1 無錫市人民醫院檢驗科 2 無錫市人民醫院神經內科

王曉明(1973-)，男，副主任醫師，博士，主要從事帕金森病病因及臨床治療研究。

常春艷(1981-)，女，助理研究員，博士，主要從事帕金森病分子生物學研究。