Th17細胞亞群在小鼠呼吸道合胞病毒感染后宿主免疫機制中的作用

李 燕 薛建芳

(包頭市中心醫院檢驗科，內蒙古 包頭 014040)

Th17細胞亞群在小鼠呼吸道合胞病毒感染后宿主免疫機制中的作用

李 燕 薛建芳1

(包頭市中心醫院檢驗科，內蒙古 包頭 014040)

目的探討輔助性T淋巴細胞(Th)17在呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠肺部炎癥中的變化及其在RSV感染后宿主免疫機制中的作用。方法30只5周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為實驗組和對照組各15只。對照組小鼠鼻腔滴入0.1 ml DMEM維持液(含有2.5%滅活的雞血清)，實驗組小鼠鼻腔滴入0.1 ml病毒液(TCID50為107.5/ml)。在處理后的第1、3、7天分別處死小鼠，取其外周血并留取小鼠脾臟和肺臟組織。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠外周血中白細胞介素(IL)-17A和IL-23p19的濃度。通過蘇木素-伊紅(HE)染色觀察RSV感染后肺組織病理變化。通過流式細胞術檢測小鼠脾臟淋巴細胞中Th17細胞亞群的含量變化。結果實驗組小鼠在RSV病毒感染后1、3、7 d，血清IL-17A濃度較對照組明顯升高(Plt;0.05)。在RSV病毒感染的第3天和第7天，實驗組小鼠血清中IL-23p19的濃度較對照組明顯升高(Plt;0.05)；在RSV病毒感染后第1、3、7天，實驗組小鼠脾淋巴細胞Th17亞群比例顯著高于對照組(Plt;0.05)，且RSV病毒感染后第7天明顯高于第1、3天(Plt;0.05)；在RSV感染后第3天小鼠肺組織出現典型間質性肺炎表現，第7天炎性細胞明顯減少。實驗組第3、7天小鼠肺組織病理改變評分高于對照組(Plt;0.05)。結論在RSV感染小鼠導致的肺部炎癥反應過程中，脾淋巴細胞Th17細胞亞群水平升高并且外周血血清中IL-17A的表達增加，推測Th17細胞可能參與宿主的抗病毒免疫過程。

呼吸道合胞病毒；輔助性T淋巴細胞；白細胞介素-17A

呼吸道感染是臨床常見疾病，呼吸道合胞病毒(RSV)是眾多病原體中導致呼吸道急性炎癥并具有較高致病率和致死率的病毒之一〔1〕。RSV是具有包膜、非節段性、單股負鏈的RNA病毒，屬于副黏病毒科、肺病毒屬，只有一個血清型，A和B兩個亞型〔2〕。引起全球嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原體是RSV，感染此種病毒后能夠引起嬰幼兒反復喘息、持續性的氣道功能紊亂、缺氧等癥狀，更能誘發嚴重的肺炎毛細支氣管炎〔3〕。輔助性T淋巴細胞(Th)17作為CD4+Th細胞亞群，主要分泌白細胞介素(IL)-17A，此外還分泌IL-6、IL-23、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等細胞因子，這些細胞因子都是強效的炎性細胞趨化因子，能募集炎性細胞到達炎癥部位〔4〕。本研究旨在探討RSV感染后Th17細胞在宿主免疫反應過程中的變化情況及其作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 0.25%胰酶細胞消化液(北京達科為生物工程有限公司，中國)；酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(BD公司，美國)；小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒(天津灝洋有限公司，中國)；胎牛血清、雞血清(杭州四季青生物科技有限公司，中國)；淋巴細胞刺激物PMA和lonomycin，臺盼蘭細胞染色液，淋巴細胞高爾基體阻斷劑Brefedin A(BFA)(Sigma公司，美國)；改良型RPMI-1640培養基(HyClone公司，美國)；PerCP/Cy5標記抗小鼠CD3單克隆抗體及同型對照抗體、PE標記抗小鼠IL-17A單克隆抗體及同型對照抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記抗小鼠CD4單克隆抗體以及同型對照抗體(BD公司，美國)；流式細胞儀(BD FACSCalibur，美國)。

1.2細胞和病毒 在37℃，5%CO2細胞培養箱中利用包含10%胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素的改良型RPMI-1640培養基培養Hep-2細胞(包頭醫學院遺傳教研室提供)，然后進行細胞傳代，待細胞狀態良好時滴入RSV A亞型Long株(包頭醫學院病原教研室饋贈)病毒原液，然后在DMEM維持液(含2.5%滅活雞血清)中培養，經過3次細胞傳代，待Hep-2細胞病變達 80%時收獲病毒。具體步驟：首先收集Hep-2細胞，然后在37℃水浴和-80℃冰箱溫度之間反復凍融3次，4 000 r/min離心10 min后，收集上清液，運用96孔板組織細胞培養半數感染量(TCID50)測定并計算病毒滴度為107.5/ml，分裝后置于-80℃冰箱保存備用。

1.3建模 5周齡BALB/c小鼠(購自第四軍醫大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(軍)2007-007)30只。隨機分為對照組和實驗組。所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)進行完全麻醉后，對照組(n=15)小鼠鼻腔緩慢滴入0.1 ml的2.5%滅活雞血清的DMEM維持液。實驗組(n=15)小鼠鼻腔緩慢滴入0.1 ml病毒液(TCID50為107.5/ml)。把種病毒的當天，定為第0天，分別在1、3、7 d眼球取血并處死小鼠取脾臟和肺臟。

1.4小鼠外周血IL-17A、IL-23p19細胞因子的表達 將小鼠外周血在20℃下靜置2 h，10 000 r/min離心10 min取血清。根據ELISA試劑盒說明書，首先利用試劑盒提供的標準品制作標準曲線，然后經過加樣、溫育、洗滌后用底物顯色，終止顯色等步驟后，利用酶標儀(賽默飛，美國)在450 nm波長下測定吸光度(OD)值，計算樣品濃度。

1.5小鼠脾淋巴細胞的分離 用無菌眼科剪將脾臟剪成碎塊后置細胞篩中，用注射器活塞頭研磨組織碎塊，用試劑盒中附帶的組織稀釋液5 ml沖洗細胞篩，濾液轉移至新的15 ml離心管中，在室溫300 r/min離心5 min后棄上清。取含有1%胎牛血清的RPMI1640培養液3 ml重懸細胞，重懸的細胞懸液收集后小心轉移至分裝有脾淋巴細胞分離液的15 ml離心管中，25℃，300 r/min，離心20 min。小心吸取分離出來的白色淋巴細胞層，磷酸酸緩沖液(PBS)清洗，做細胞計數。淋巴細胞轉移至透氣細胞培養瓶中，按每3 ml含106個細胞濃度補加含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，添加丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)，添加Ionomycin和BFA至1 μmol/L，再繼續放入細胞培養箱中刺激培養6 h。離心后加入PerCP/Cy5標記抗小鼠CD3單克隆抗體及同型對照抗體、PE標記抗小鼠IL-17A單克隆抗體及同型對照抗體、FITC標記抗小鼠CD4單克隆抗體及同型對照抗體。洗滌后加200 μl的染色緩沖液重懸細胞，流式細胞儀檢測，采用FLOWJO 7.6 進行分析。

1.6小鼠肺組織病理檢查 脫頸處死小鼠，將剖取的無菌左肺放入裝有10%甲醛溶液的玻璃瓶內，在密封真空后肺組織完全沉于瓶底，然后固定充分24 h，最后進行石蠟包埋、切片及蘇木素-伊紅(HE)染色，最終通過光學顯微鏡觀察小鼠肺組織病理學改變。在200倍光學顯微鏡下由病理專業人員閱片，根據評分標準〔5〕：肺泡壁充血、炎性細胞浸潤、水腫各計1分；腔內滲出、肺內支氣管上皮變性各計1分；肺氣腫、肺泡腔滲出計1分。累加所有分數，即為病理得分 。

1.7統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1外周血中細胞因子IL-23p19、IL-17A的表達 實驗組小鼠在RSV感染后1、3、7 d，血清IL-17A濃度分別為(36.31±0.89)pg/ml、(126.31±2.14)pg/ml、(100.10±1.14)pg/ml，分別高于對照組的(24.87±0.91)pg/ml、(26.39±0.88)pg/ml、(25.01±1.02)pg/ml(Plt;0.05)，實驗組感染后第3天顯著高于第1天，而感染后第7天低于第3天(均Plt;0.05)。在RSV感染后第1、3、7天，實驗組血清IL-23p19濃度分別為(38.54±0.94)pg/ml、(80.31±0.98)pg/ml、(60.61±0.34)pg/ml，分別高于對照組的(20.21±0.72)pg/ml、(19.41±0.43)pg/ml、(20.66±0.81)pg/ml，實驗組感染后第3、7天較第1天均顯著升高(Plt;0.05)。

2.2小鼠脾淋巴細胞Th17細胞亞群的變化 在RSV感染后第1、3、7天，實驗組小鼠脾淋巴細胞Th17亞群比例分別為(0.37±0.04)%、(0.46±0.08)%和(0.98±0.03)%，顯著高于對照組的(0.22±0.04)%、(0.26±0.03)%、(0.21±0.07)%(均Plt;0.05)，且實驗組RSV感染后第7天明顯高于第1天和第3天(Plt;0.05)。

2.3小鼠肺組織病理學變化 對照組小鼠肺泡壁光滑，肺間質無炎性細胞浸潤，肺組織未見異常變化。實驗組小鼠在病毒感染后第1天肺間質已有炎性細胞浸潤，第3天小鼠肺組織出現典型間質性肺炎表現，毛細血管擴張充血，肺泡腔明顯狹窄，炎性細胞浸潤，第7天可見肺間質的炎性細胞浸潤較第3天明顯減輕。第1、3、7天實驗組小鼠肺組織病理改變評分分別為(3.30±0.76)分、(5.60±0.65)分、(4.00±0.71)分，與對照組的(0.80±0.35)分相比，第3、7天明顯高于對照組(Plt;0.05)。見圖1。

圖1 各組肺組織在RSV 感染后1、3、7 d的病理變化(HE，×400)

3 討 論

RSV感染引起的RSV肺炎是導致嬰幼兒下呼吸道感染的常見原因，患病時年齡越小，RSV病毒的表達量越高，其病情會越嚴重，從而導致住院時間及臨床反應持續的時間越長〔6〕。嬰兒時期有嚴重RSV肺炎病史的兒童，以后發展成哮喘等過敏性疾病的概率就會增加，而且可能影響兒童免疫系統的發育。RSV感染可引起包括Th1和Th2細胞分泌的細胞因子及T細胞亞群比例失衡的現象〔7〕。Th1類免疫反應是最及時最有效的抗感染機制，Th1相關途徑中任何一個環節受制約都會造成感染加重和持續，例如不能產生高濃度干擾素(IFN)-γ、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)或活性一氧化氮(NO)及抗感染因子IL-10含量降低，容易形成肺部肉芽腫〔8〕。在以往的研究中〔9〕，Th1、Th2平衡能夠解釋免疫反應中的炎癥反應機制，Th1類反應一般是對病原導致的急性期炎癥的應答，而Th2則是與病原清除和感染恢復有關。IL-4是Th2細胞分化的重要細胞因子，IFN-γ和IL-4既分別是Th1和Th2類細胞的自分泌細胞生長因子，也是有互相抑制作用的細胞因子〔10〕。

Th17作為一種輔助性T細胞，由在IL-6和IL-23的刺激下TH0細胞分化而產生，主要分泌促炎癥因子包括IL-17、IL-22等，在機體防御反應和自身免疫性疾病中具有重要的臨床意義〔11〕。IL-17是一種前炎性細胞因子，能夠招募中性粒細胞和促進多種細胞釋放炎性因子的功能，可以增加氣道的高反應性，刺激氣道黏液腺大量分泌黏液，在哮喘氣道重塑的過程中起到重要的作用。 IL-23雖然不是啟動初始CD4+T細胞分化Th17的關鍵因子，但當Th17 細胞分化處于后期時能起到穩定分化的作用，研究顯示小鼠缺乏IL-23幾乎不能分化出 Th17淋巴細胞〔12〕。本實驗結果說明IL-17參與了機體的抗病毒免疫反應。本研究還發現在RSV感染后第3天血清IL-23p19水平含量到達峰值，但是第7天有所下降，這可能是因為IL-23p19的刺激分化Th17細胞。在RSV感染后的第3天和第7天，小鼠脾臟淋巴細胞中Th17細胞水平顯著升高，于第7天處于峰值，然而這時肺組織中的炎癥反應卻有所降低，這可能是病毒感染后機體受到刺激啟動免疫反應，使得 Th17細胞轉移至脾臟中，參與抗病毒免疫，并在病毒被清理后保持一定的免疫反應。胡嬋嬋等〔13〕研究顯示其模型組在感染RSV的第3天，Th17的數量明顯升高，同本研究結果一致，用RSV(Long株)滴鼻48 h后檢測肺部病理得分同對照組相比具有統計學意義，而本研究結果是在第3和7天有統計學意義，可能是由于研究方法不同或沒有檢測48 h的結果引起的。總之，小鼠在RSV感染后，脾淋巴細胞中Th17細胞的比例升高且外周血血清中 IL-17A的表達增高，本次研究表明Th17淋巴細胞亞群及其分泌的IL-17A和IL-23p19炎性細胞因子參與了宿主抗病毒的免疫反應過程。

1季 健,邵雪君,張學蘭,等.急性呼吸道感染患兒鼻咽分泌物中呼吸道合胞病毒亞型的檢出分析〔J〕.臨床兒科雜志,2014;32(4):375-8.

2張小瑜,趙 燕,王導新,等.羅格列酮通過減少Th17細胞極化減輕LPS誘導的小鼠急性肺損傷〔J〕.基礎醫學與臨床,2016;36(7):902-6.

3Sim?es EA,Anderson EJ,Wu X,etal.Effects of chronologic age and young child exposure on respiratory syncytial virus disease among US preterm infants born at 32 to 35 weeks gestation〔J〕.PLoS One,2016;11(11):e0166226.

4劉瑞清,張國成,黃可飛,等.重組人干擾素α1b對呼吸道合胞病毒感染小鼠外周血T淋巴細胞亞群及肺組織病理學的影響〔J〕.現代生物醫學進展,2013;13(9):1639-44.

5徐欣欣,董楊陽,楊 玲,等.流感嗜血桿菌下氣道定植對哮喘小鼠肺組織TH17細胞表達及氣道重塑的影響〔J〕.醫學研究雜志,2016;45(10):24-30,47.

6Zhou L,Xiao Q,Zhao Y,etal.The impact of viral dynamics on the clinical severity of infants with respiratory syncytial virus bronchiolitis〔J〕.J Med Virol,2015;87(8):1276-84.

7趙茜葉,周旭華,于艷艷,等.呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎患兒Th17細胞亞群的變化〔J〕.臨床兒科雜志,2014;32(2):193.

8Kim TH,Lee HK.Innate immune recognition of respiratory syncytial virus infection〔J〕.BMB Rep,2014;47(4):184-91.

9Yoshizaki A,Yanaba K,Iwata Y,etal.Cell adhesion molecules regulate fibrotic process via Th1/Th2/Th17 cell balance in a bleomycin-induced scleroderma model〔J〕.J Immunol,2010;185(4):2502-15.

10Zhang HL,Zheng XY,Zhu J.Th1/Th2/Th17/Treg cytokines in Guillain-Barré syndrome and experimental autoimmune neuritis〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev,2013;24(5):443-53.

11Rodeghero R,Cao Y,Olalekan SA,etal.Location of CD4+ T cell priming regulates the differentiation of Th1 and Th17 cells and their contribution to arthritis〔J〕.J Immunol,2013;190(11):5423-35.

12Feng J,Hu Y,Song Z,etal.Interleukin-23 facilitates Th1 and Th2 cell differentiation in vitro following respiratory syncytial virus infection〔J〕.J Med Virol,2015;87(4):708-15.

13胡嬋嬋,袁 斌,周立華,等.清肺口服液對RSV感染小鼠Treg/Th17及IL-2和IL-17水平的影響〔J〕.中國中醫急癥,2016;6(25):941-4.

〔2017-03-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

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A

1005-9202(2017)21-5271-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.023

1 包頭市中心醫院兒科

李 燕(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事微生物方面的研究。