乙型肝炎B病毒X相關蛋白對宮頸癌細胞增殖及遷移的影響

符 婕 陳立平 宋立艷 王偉群

(佳木斯市中心醫院婦產科，黑龍江 佳木斯 154002)

乙型肝炎B病毒X相關蛋白對宮頸癌細胞增殖及遷移的影響

符 婕 陳立平 宋立艷 王偉群1

(佳木斯市中心醫院婦產科，黑龍江 佳木斯 154002)

目的研究乙型肝炎B病毒X相關蛋白(HBXAP)基因對Hela和C-33A宮頸癌細胞增殖及遷移的影響及機制。方法利用基因轉染及RNA干擾分別構建過表達HBXAP的Hela細胞株和低表達HBXAP的C-33A細胞株。細胞計數試劑(CCK)8和Transwell實驗研究過表達及低表達HBXAP基因對Hela和C-33A細胞增殖及遷移的影響，Western印跡檢測ERK蛋白表達情況。結果過表達HBXAP促進Hela細胞的增殖、遷移及上調ERK蛋白的表達，沉默HBXAP基因抑制C-33A的增殖、遷移及下調細胞外信號調節激酶(ERK)蛋白的表達。結論HBXAP可經絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK途徑參與宮頸癌的發生及演進過程。

宮頸癌；乙型肝炎B病毒X相關蛋白(HBXAP)；細胞外信號調節激酶

宮頸癌(UCC)發病率位居女性所有腫瘤中的第二位，僅次于乳腺癌〔1〕。宮頸癌主要治療手段是外科手術結合放、化療，但近年來分子靶向治療也逐步被應用到宮頸癌中。但由于調控宮頸癌分子病理學機制仍未能深入揭示，因此分子靶向治療不能得到廣泛推廣及應用。深入闡明宮頸癌分子機制，將有利于為宮頸癌的分子靶向治療提供潛在靶點。乙型肝炎B病毒X相關蛋白(HBXAP)又稱重塑因子(Rsf)-1，其可經影響核小體的相對位置來發揮轉錄活性，并最終影響細胞的基因表達及細胞周期〔2〕。HBXAP在人類多種腫瘤中表現為高表達，并且其可經不同信號途徑參與腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲等惡性行為〔3〕。本實驗探討HBXAP對宮頸癌細胞致癌潛能的影響。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑、儀器 Hela及C-33A細胞(中科院細胞庫)，RPMI1640培養基(美國Gibco)；胎牛血清(美國NQBB)；雙抗、胰酶(武漢博士德)；腺病毒載體及包裝試劑盒(美國Gene Copoeia)；蛋白裂解液(中國碧云天)；HBXAP、細胞外信號調節激酶(ERK)抗體(美國Santa Cruz)；CO2培養箱(常州華冠)；倒置顯微鏡(德國Leica)；電泳槽、轉移槽(美國Biorad)。

1.2細胞轉染 轉染前，將Hela及C-33A細胞分別種于24孔板中(10×104細胞/孔)，細胞生長于0.5 ml含5%熱滅活胎牛血清、100 μg/ml雙抗的RPMI1640培養基中；24 h后，棄除培養基，向Hela細胞培養孔中分別加入含HBXAP過表達載體及空載體病毒的RPMI1640完全培養基，向C-33A細胞培養孔中分別加入含HBXAP-shRNA載體和亂序-shRNA載體病毒的RPMI1640完全培養基；待細胞培養48 h后，更換含濃度5 ng/μl 嘌呤霉素的1640完全培養基繼續；待細胞培養至5 d，用Wstern印跡實驗鑒定轉染效率。

1.3Western印跡實驗 提取細胞的總蛋白，定量后取50 μg總蛋白上樣于12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行恒壓電泳；利用轉移槽將凝膠中分離的蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h；磷酸緩沖液-吐溫(PBS-T)洗膜3次×5 min；分別用HBXAP(1∶500)和ERK(1∶500)抗體在4℃環境中孵育過夜；PBS-T洗膜3次×5 min；加入相應二抗(1∶10 000)于37℃環境中孵育45 min；PBS-T洗膜4×20 min；加入顯影液于暗室曝光。

1.4細胞計數試劑(CCK)-8實驗 將HBXAP過表達Hela細胞株(Overexpression)、空載體轉染Hela細胞株(Mock)、HBXAP-shRNA C-33A細胞株(HBXAP-shRNA)和亂序-shRNA C-33A細胞株(Mock--shRNA)分別接種于96孔板(3×103個/孔)；48 h后向每孔中加入10 μl CCK-8；將孔板置于培養箱中2 h；酶標儀讀取450 nm處吸光度值。

1.5Transwell實驗 將Overexpression、Mock、HBXAP-shRNA和Mock-shRNA細胞分別接種于上室中(1×104/室)，上室為100 μl無血清的RPMI1640培養基，下室為600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基；培養24 h后，PBS沖洗小室；棉簽擦除上室未遷移細胞；0.1%結晶紫染色、晾干后于鏡下計數及拍照。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行q檢驗。

2 結 果

2.1轉染細胞株的鑒定 HBXAP在Mock和Overexpression Hela細胞株的表達量分別為(1.36±0.09)和(5.26±0.45)，二者差異顯著(Plt;0.01)，而在Mock-shRNA和HBXAP-shRNA C-33A細胞株的表達量分別為(3.99±0.67)和(0.59±0.39)，二者差異顯著(Plt;0.01)，這說明成功構建了過表達HBXAP的Hela細胞株和低表達HBXAP的C-33A細胞株，見圖1。

2.2過表達HBXAP促進Hela細胞的增殖和遷移 Mock和Overexpression Hela細胞株的吸光度值分別為(1.38±0.33)和(2.40±0.32)，二者差異顯著(Plt;0.01)，24 h后兩組遷移的細胞數分別為(63.50±0.97)個和(121.5±21.08)個，二者差異顯著(Plt;0.01)，見圖2。

2.3沉默HBXAP抑制C-33A細胞的增殖和遷移 亂序-shRNA和HBXAP-shRNA C-33A細胞株的吸光度值分別為(1.91±0.19)和(1.22±0.24)，二者差異顯著(Plt;0.01)，24 h后兩組遷移的細胞數分別為(160.83±23.22)和(105.33±23.96)，二者差異顯著(Plt;0.01)。見圖3。

圖1 HBXAP及ERK在細胞中的表達

圖2 過表達HBXAP促進Hela細胞增殖和遷移Transwell實驗

圖3 沉默HBXAP抑制C-33A細胞的增殖和遷移Transwell實驗

2.4HBXAP調控ERK基因表達 與Mock(0.52±0.21)比較，ERK在Overexpression的表達量(1.49±0.30)明顯提高(Plt;0.01)。與亂序-shRNA(3.39±0.48)比較，ERK在HBXAP-shRNA的表達量(0.56±0.15)明顯降低(Plt;0.01)。

3 討 論

HBXAP是與組蛋白和染色質重塑有關的因子，其可在細胞核中與蔗糖非發酵蛋白2同源物(hSNF2H)結合而形成染色質重塑復合物(RAF)。在RAF復合物中，HBXAP作為的組蛋白的分子伴侶可影響和調控RAF與DNA的結合，而具有ATP酶和解螺旋酶活性的hSNF2H可調控核小體的位移及影響DNA解螺旋，最終導致染色體重組和基因轉錄過程〔4〕。HBXAP基因在人類多種腫瘤如肝癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌中存在表達上調，并且其表達量與腫瘤分期、分級和預后等臨床病理參數相關〔3〕。Shih等〔5〕報道，當使OVCAR3卵巢癌細胞中的HBXAP基因表達下調后，細胞增殖活性可受到明顯抑制。而Sheu等〔6〕研究表明，卵巢癌細胞轉染HBXAP基因后，可顯著促進其在裸鼠體內的成瘤能力。在非小細胞肺癌中，當將高表達內源性HBXAP基因的H1299和H460細胞中HBXAP沉默后可抑制細胞的侵襲和遷移活性，同時可下調基質金屬蛋白酶(MMP)2和核因子(NF)-κB基因的表達，由此推斷HBXAP可經MMP2和NF-κB途徑調控肺癌細胞的侵襲進程〔7〕。

Li等〔8〕報道在肺癌細胞中沉默HBXAP表達可抑制細胞的克隆形成和細胞周期進程，促進細胞的凋亡，同時細胞周期素D1和磷酸化ERK表達也被下調。與本研究結果相近，由此可見，HBXAP可經絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號途徑參與腫瘤的發生與演進過程。MAPKs是一類位于細胞質中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，家族成員可經磷酸化而被活化，而后進入細胞核中調控靶基因的轉錄及翻譯，故可影響細胞的多種功能，如調控細胞的生長、分化和凋亡等〔9〕。在人類體細胞中最為經典MAPK信號通路是ERK通路，它由兩個差異結構分子ERK1和ERK2組成。MAPK/ERK通路包括小G蛋白Ras、MAPKK激酶Raf(MAPKKK)、MAPK/ERK激酶(MEK)和ERK等信號分子，該通路可通過分子間的級聯放大過程轉導信號。Corona等〔10〕報道，當抑制ERK的磷酸化可以下調cyclin D1基因的表達，這說明ERK通路在調控細胞周期中發揮重要作用。另外，ERK可上調抗凋亡基因如Bcl-2、Caspase-3等的表達而參與乳腺癌的進程〔11〕。

1Siegel R,Ma J,Zou Z,etal.Cancer statistics,2014〔J〕.CA Cancer J Clin,2014;64(1):9-29.

2Shamay M,Barak O,Shaul Y.HBXAP,a novel PHD-finger protein,possesses transcription repression activity〔J〕.Genomics，2002;79(4):523-9.

3沈 帥,楊連赫,于承仟,等.Rsf-1與腫瘤關系的研究進展及相關作用機制〔J〕.現代腫瘤醫學,2016;24(16):2660-3.

4Loyola A,Huang JY,LeRoy G,etal.Functional analysis of the subunits of the chromatin assembly factor RSF〔J〕.Mol Cell Biol,2003;23(19):6759-68.

5Shih IM,Sheu JJ,Santillan A,etal.Amplification of a chromatin remodeling gene,Rsf-1/HBXAP,in ovarian carcinoma〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2005;102(39):14004-9.

6Sheu JJ,Choi JH,Yildiz I,etal.The roles of human sucrose nonfermenting protein 2 homologue in the tumor-promoting functions of Rsf-1〔J〕.Cancer Res,2008;68(11):4050-7.

7Zhang X,Fu L,Xue D,etal.Overexpression of Rsf-1 correlates with poor survival and promotes invasion in non-small cell lung cancer〔J〕.Virchows Arch,2017;470(5):553-60.

8Li Q,Dong Q,Wang E.Rsf-1 is overexpressed in non-small cell lung cancers and regulates cyclinD1 expression and ERK activity〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2012;420(1):6-10.

9Finegan KG,Perez-Madrigal D,Hitchin JR,etal.ERK5 is a critical mediator of inflammation-driven cancer〔J〕.Cancer Res,2015;75(4):742-53.

10Corona G,Deiana M,Incani A,etal.Hydroxytyrosol inhibits the proliferation of human colon adenocarcinoma cells through inhibition of ERK1/2 and cyclin D1〔J〕.Mol Nutr Food Res,2009;53(7):897-903.

11齊世美，呂 俊，孟 宇，等.七葉皂苷鈉通過抑制AKT，ERK上游信號SRC活性誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡〔J〕.中國中藥雜志，2015；40(16)：3267-72.

〔2016-11-27修回〕

(編輯 苑云杰)

R737.33

A

1005-9202(2017)21-5267-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.021

1 佳木斯大學基礎醫學院

王偉群(1974-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事腫瘤病理生理學研究。

符 婕(1977-)，女，副主任醫師，主要從事女性生殖系統病理生理學研究。