Six1對甲狀腺癌細胞侵襲遷移的影響

羅 方 許玲玉 李清楚 康志強

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院內分泌科，河南 鄭州 450000)

Six1對甲狀腺癌細胞侵襲遷移的影響

羅 方 許玲玉 李清楚 康志強

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院內分泌科，河南 鄭州 450000)

目的探討Six1對甲狀腺癌細胞侵襲遷移的影響。方法甲狀腺癌BCPAP細胞轉染Six1小干擾RNA(Six1 siRNA)和小干擾RNA陰性對照(siRNA control)，采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移，Transwell小室檢測細胞侵襲，Western印跡檢測Six1、神經鈣黏素(N-cadherin)、上皮鈣黏附素(E-cadherin)蛋白表達。結果轉染siRNA control后的BCPAP細胞遷移率、侵襲細胞數目及細胞中Six1、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達水平與沒有轉染的BCPAP細胞相比無變化。轉染Six1 siRNA后的BCPAP細胞遷移率、侵襲細胞數目及細胞中Six1、N-cadherin蛋白表達水平與沒有轉染的BCPAP細胞相比明顯降低，而E-cadherin蛋白水平明顯升高。結論敲低Six1可能通過影響E-cadherin、N-cadherin表達抑制甲狀腺癌細胞侵襲遷移。

甲狀腺癌；Six1；侵襲；遷移

甲狀腺癌屬于內分泌系統腫瘤，其發病率在全部惡性腫瘤中占1%，碘元素缺乏、放射線、甲狀腺功能異常及遺傳等均能夠引起甲狀腺癌的發生〔1〕。手術治療、內分泌治療、放射性核素治療是目前常用的治療方法。Six1是一種與胚胎發育有關的轉錄因子，在正常的發育成熟組織中極少表達，而在多種腫瘤組織中表達上調〔2〕。Six1表達上調常與乳腺癌等腫瘤的預后有關〔3〕，有研究表明Six1影響宮頸癌等腫瘤細胞轉移和增殖能力〔4〕。本研究通過細胞轉染的方法下調甲狀腺癌細胞中Six1的表達，初步探討Six1敲低對甲狀腺癌細胞侵襲遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 甲狀腺癌BCPAP細胞購自中科院細胞庫；Six1抗體購自美國Santa Cruz ；Lipofectamine?RNAiMAX轉染試劑購自美國Thermo；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自北京TIANGEN ；神經鈣黏素(N-cadherin)抗體、上皮鈣黏附素(E-cadherin)抗體、β肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國Sigma；胎牛血清購自美國Gibco；倒置顯微鏡購自日本Olympus Corporation。

1.2細胞分組及轉染 甲狀腺癌BCPAP細胞在含有10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和鏈霉素的RPMI1640細胞培養液中培養。在相對濕度95%，5%CO2，37℃的培養箱中培養。期間每隔3 d進行一次傳代，0.25%的胰蛋白酶消化傳代。觀察細胞飽和度約為70%時進行細胞轉染，轉染步驟參照Lipofectamine?RNAiMAX轉染試劑說明書。將轉染siRNA-Six1和siRNA control的細胞分別記為siRNA-Six1組、陰性對照組，同時以沒有轉染的細胞為未轉染組。

1.3細胞劃痕檢測細胞遷移 在6孔細胞培養板的背面用記號筆均勻的劃線。取未轉染組、陰性對照組、siRNA-Six1組細胞，按照每孔中加入5×105個細胞接種到劃線后的細胞培養板中，培養1 d待細胞長滿后用移液槍槍頭垂直的在培養板上劃出細痕，使細痕與培養板背面的劃線重合。用磷酸鹽緩沖液(PBS)將劃下來的細胞清洗干凈，加入不含有血清的細胞培養液，在培養24 h后拍照，實驗重復3次，每組設置3個復孔。計算細胞遷移率。

1.4Transwell小室檢測細胞侵襲 侵襲實驗用8 μm孔徑的24孔板Transwell小室進行實驗，在實驗前48 h取出matrigel放置于冰上融化，按照50 μl/cm2加入Transwell小室，在37℃下孵育30 min。在Transwell小室的上室加入100 μl不含胎牛血清細胞培養液稀釋的未轉染組、陰性對照組、siRNA-Six1組細胞(細胞懸浮液密度為109個/L)，在下室中加入600 μl含有10%胎牛血清的細胞培養液。培養48 h后將Transwell小室取出，用棉簽將沒有穿膜的細胞擦掉，PBS洗滌后用4%甲醛固定，吉姆薩染色后在顯微鏡下觀察穿膜的細胞數目，選取5個視野，實驗重復3次。

1.5Western印跡檢測Six1、N-cadherin、E-cadherin表達 未轉染組、陰性對照組、siRNA-Six1組細胞培養48 h后，提取細胞總蛋白(操作步驟參照蛋白提取試劑盒)，采用BCA法對蛋白樣品進行定量檢測。把蛋白樣品加入到5倍上樣緩沖液中100℃煮沸5 min。每組蛋白樣品取50 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃轉膜90 min，5%脫脂奶粉在室溫封閉60 min，依次與一抗和二抗結合后，ECL發光，ChemiDoc XRS成像，Image Lab對蛋白定量并以β-actin為內參。

1.6統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差。

2 結 果

2.1Six1下調對細胞遷移的影響 未轉染組、陰性對照組、siRNA-Six1組細胞遷移率分別為(51.47±5.68)%、(52.69±4.92)%、(21.84±3.54)%。陰性對照組與未轉染組相比差異無統計學意義(Pgt;0.05)。siRNA-Six1組與未轉染組相比明顯降低(Plt;0.05)。

2.2Six1下調對細胞侵襲的影響 未轉染組、陰性對照組、siRNA-Six1組細胞侵襲數目分別為(325.84±36.25)個、(324.75±33.55)個、(213.36±24.17)個。陰性對照組與未轉染組相比差異無統計學意義(Pgt;0.05)。siRNA-Six1組與未轉染組相比明顯降低(Plt;0.05)。

2.3N-cadherin、E-cadherin、Six1蛋白表達 未轉染組、陰性對照組、siRNA-Six1組細胞Six1蛋白水平分別為0.62±0.04、0.64±0.05、0.25±0.03，N-cadherin蛋白水平分別為1.17±0.15、1.19±0.10、0.85±0.08，E-cadherin蛋白水平分別為0.35±0.03、0.34±0.05、1.10±0.12。陰性對照組N-cadherin、E-cadherin、Six1蛋白水平與未轉染組相比差異無統計學意義(Pgt;0.05)。siRNA-Six1組Six1、N-cadherin蛋白水平與未轉染組相比明顯降低，E-cadherin蛋白水平明顯升高(t1=,t2=,t3=,Plt;0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測各組細胞中N-cadherin、E-cadherin、Six1表達

3 討 論

Six1是胚胎發育過程中的重要調控因子，屬于同源盒蛋白家族成員之一，具有促進細胞生長、黏附、遷移等作用〔5〕。成熟的細胞中Six1表達水平下降，而在腫瘤細胞中發現Six1表達上調，其可以通過促進細胞增殖、入侵等導致細胞癌變，該作用已經在子宮癌、乳腺癌、肝癌、大腸癌等多種癌癥中得以證實〔6,7〕。Six1基因定位于14q23染色體上，其編碼的蛋白可以與DNA結合調控下游靶基因的轉錄，影響細胞的增殖〔8〕。Six1是一種癌基因，與腫瘤細胞的侵襲、遷移、分化、增殖等有關，正常的乳腺上皮細胞中過表達Six1后可以誘發乳腺癌并且表現出高侵襲性〔9〕。Six1表達下調后的骨肉瘤細胞增殖能力下降，細胞侵襲和遷移能力也明顯下降〔10〕。

腫瘤細胞的侵襲和遷移是一個多步驟的復雜過程，也是腫瘤轉移的基礎。癌細胞擴散首先需要脫離原發病灶，也就是脫離癌細胞之間的黏附，其中E-cadherin發揮重要作用〔11〕。E-cadherin是一個跨膜糖蛋白，分子量為120 kD，為鈣黏素家族的成員之一，其在癌癥中表達下調，是癌細胞侵襲和遷移能力增加的重要原因〔12〕。N-cadherin是另外一個參與細胞遷移的鈣黏素成員，是一種神經鈣黏素，其與E-cadherin作用不同，在癌癥轉移中發揮促進作用〔13〕。

本研究成功構建了Six1下調的甲狀腺癌細胞株，提示Six1下調能夠抑制甲狀腺癌細胞侵襲和遷移能力，Six1表達降低后能夠通過抑制甲狀腺癌細胞中N-cadherin表達并促進E-cadherin表達發揮作用。

1田 文,郗洪慶.甲狀腺癌病人生存現狀分析〔J〕.中國實用外科雜志,2016;36(5):489-93.

2Negrisolo S,Centi S,Benetti E,etal.SIX1 gene:absence of mutations in children with isolated congenital anomalies of kidney and urinary tract〔J〕.J Nephrol,2014;27(6):667-71.

3馬小斌,宋雅皤,陳洪志,等.乳腺癌患者血清中 Six1 的檢測及臨床意義〔J〕.現代腫瘤醫學,2015;23(17):2450-2.

4Shi C,Zhang Z.MicroRNA-362 is downregulated in cervical cancer and inhibits cell proliferation,migration and invasion by directly targeting SIX1〔J〕.Oncol Rep,2017;37(1):501-9.

5Wu W,Ren Z,Zhang L,etal.Overexpression of Six1 gene suppresses proliferation and enhances expression of fast-type muscle genes in C2C12 myoblasts〔J〕.Mol Cell Biochem,2013;380(1-2):23-32.

6金愛花,金海燕.Six1 蛋白在惡性腫瘤中的研究進展〔J〕.臨床與實驗病理學雜志,2014;30(4):437-40.

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8Feng GW,Dong LD,Shang WJ,etal.HDAC5 promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma by up-regulating Six1 expression〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014;18(6):811-6.

9Wang CA,Jedlicka P,Patrick AN,etal.SIX1 induces lymphangiogenesis and metastasis via upregulation of VEGF-C in mouse models of breast cancer〔J〕.J Clin Invest,2012;122(5):1895.

10謝柏臻,陳安民,郭風勁,等.RNAi 下調 Six1 基因對人骨肉瘤細胞增殖和轉移能力的影響〔J〕.中國癌癥雜志,2008;18(8):561-5.

11張曉勇,魏琳琳.子宮內膜樣腺癌術后組織中 claudin3,7 和 E-cadherin 的表達及關系〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(20):5813-5.

12Carvalho S,Catarino TA,Dias AM,etal.Preventing E-cadherin aberrant N-glycosylation at Asn-554 improves its critical function in gastric cancer〔J〕.Oncogene,2016;35(13):1619.

13Huang H,Svoboda RA,Lazenby AJ,etal.Up-regulation of N-cadherin by collagen I-activated discoidin domain receptor 1 in pancreatic cancer requires the adaptor molecule Shc1〔J〕.J Biol Chem,2016;291(44):23208-23.

〔2017-08-24修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

R736.1

A

1005-9202(2017)21-5243-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.011

河南省科學技術廳科技攻關項目(2009A360015)

羅 方(1978-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事甲突眼的發病機制研究。