可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物對原位肝癌小鼠的治療效果

侯 杰 焦成斌 尚進才 張曉麗 羅 蘭

(佳木斯大學附屬第一醫院普外二科，黑龍江 佳木斯 154002)

可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物對原位肝癌小鼠的治療效果

侯 杰 焦成斌 尚進才 張曉麗 羅 蘭1

(佳木斯大學附屬第一醫院普外二科，黑龍江 佳木斯 154002)

目的評價可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物對原位肝癌小鼠的抗腫瘤效果。方法通過外科手術將肝癌H22細胞種植于昆明鼠的左肝內，構建原位肝癌小鼠腫瘤模型。將4價奧沙利鉑(Ⅳ)藥物連接到高分子載體上，組裝成納米藥物，將該納米藥物同小分子奧沙利鉑(Ⅱ)對肝癌的治療效果進行比較。結果成功構建了小鼠肝癌原位模型，并通過3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)實驗及腫瘤機制實驗證實可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物更有效，生物毒性更低。結論可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物對原位肝癌小鼠有較好的治療效果，并明顯降低了鉑藥的毒副作用。

原位肝癌模型；高分子鍵合藥；納米膠束；靶向治療

世界衛生組織統計，每年(45～55)萬人死于肝癌〔1～3〕，Jemal等〔4〕報道，全球每年肝癌新發病例超過70萬，我國每年肝癌新發病例約占全球一半以上〔5〕。據世界衛生部門統計〔6〕，肝癌的死亡率在消化系統各類惡性腫瘤中高居第2位，僅次于胃癌，我國肝癌患者平均發病年齡較輕〔7〕。肝癌的治療手段有手術、化療、放療、介入治療、中醫、中藥治療〔8〕等，目前主要是手術切除腫瘤組織〔9〕，臨床上肝癌發現多數是疾病晚期，喪失手術機會且預后較差〔10〕。為了保證治療效果，在肝癌化療方案中選用的多種化療藥物往往劑量很大，并且靶向性不強，對機體產生較明顯的毒副作用，出現高效高毒現象，化療引起的惡心、嘔吐是最常見的不良反應〔11，12〕，病人的生存質量差，生存期延長有限。提高臨床化療效果有兩點關鍵因素，①藥物對腫瘤的靶向性治療，有效提高化療藥物靶向性；②如何有效降低藥物本身對機體產生的毒副作用。臨床上肝癌患者化療時，多采用的是小分子2價的奧沙利鉑(Ⅱ)藥物，但奧沙利鉑(Ⅱ)藥物同其他鉑藥一樣，本身具有毒副作用大、靶向性差、在循環中有效血藥濃度時間短等問題。本實驗構建了昆明鼠的原位肝癌動物模型，試圖通過動物和細胞實驗證實可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米膠束M(Pt)藥物較2價奧沙利鉑(Ⅱ)更有效，生物毒性更低，具有更高效的抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1動物、細胞、主要試劑 雄性昆明小鼠，體重為18～22 g，采購自北京協和實驗動物中心；造模應用的腹水型H22肝癌細胞、RPMI1640培養基及磷酸鹽緩沖液(PBS)均為中科院長春應用化學研究所提供；實驗應用的兩親性嵌段共聚物——聚乙二醇-聚己內酯-聚賴氨酸(mPEG-b-PCL-b-PLL)與鉑(Ⅳ)的鍵合物在中科院長春應用化學研究所實驗室內合成。

1.2昆明鼠原位肝癌模型的制備 消毒條件下，注射器抽取實驗室動物房內昆明鼠腹腔內傳代保存的腹水型肝癌H22細胞株，在腹腔液中緩慢加入PBS，低速離心，棄去上清液，電子顯微鏡下精確計數肝癌H22細胞數，準確調整H22單細胞液濃度為2×107/ml備用，單只實驗昆明鼠左葉肝臟接種H22細胞數量為單細胞懸液0.05 ml(1×106個細胞)，用胰島素針注射于實驗小鼠肝左葉膈面，嚴格注意進行無菌、無瘤操作原則。造模1 w后，在實驗室嚴格消毒條件下將100只實驗小鼠實施麻醉后進行剖腹檢查，95只左肝葉可見癌腫生成，腫物表面凹凸不平，呈現灰白顏色，浸潤性生長，突出肝臟表面，質地硬，說明原位肝癌模型造模成功，其中有5只腫瘤逃逸，出現癌性腹水，遠處轉移，并有腹腔內種植轉移，原位肝癌模型實驗成瘤率為95%。

1.3細胞毒性試驗 應用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)的方法對比奧沙利鉑(Ⅱ)、M(Pt)的體外抗癌活性。

1.4組織分布 通過斷髓法分批處死實驗小鼠，分別于1、3、6、9、12、24 h摘取原位肝癌實驗小鼠的心、肝、脾、肺、腎等器官，并分離出健康肝組織及腫瘤組織，應用電感耦合等離子體發射光譜(ICP)方法提取出兩種鉑藥的金屬鉑，測定各個器官內兩種實驗藥物的鉑藥含量。

1.5腫瘤抑制實驗 原位肝癌實驗小鼠，分別隨機抓取18只作為對照組(注射生理鹽水)、奧沙利鉑(Ⅱ)組及M(Pt)組，分別于1、3、5、7、9、11 d處死每組各3只，將原位肝癌腫瘤組織完整剝除，采用腫瘤的體積測量公式：長×寬2×0.5〔13〕，電腦測算出每組肝臟腫瘤的體積，取平均值。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t、χ2檢驗。

2 結 果

2.1兩種藥物對人肝腫瘤細胞株(HepG-2)48、72 h的細胞毒性 48 h內，奧沙利鉑(Ⅱ)對HepG-2細胞的毒性較M(Pt)大，HepG-2細胞的殺滅效果較M(Pt)好；隨時間延長，72 h M(Pt)對HepG-2細胞的毒性較奧沙利鉑(Ⅱ)大，對HepG-2細胞的殺滅效果較奧沙利鉑(Ⅱ)好，差異均顯著(均Plt;0.05)。見圖1。

圖1 奧沙利鉑(Ⅱ)、M(Pt)對HepG-2細胞48、72 h的細胞毒性

2.2兩種藥物在不同器官的含量 M(Pt)在心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織中含量均顯著高于奧沙利鉑(Ⅱ)(Plt;0.05)，見圖2。

2.3兩種藥物對腫瘤體積的抑制效果 M(Pt)組對腫瘤體積的抑制效果顯著好于奧沙利鉑(Ⅱ)組(Plt;0.05)。見圖3。

圖2 奧沙利鉑(Ⅱ)、M(Pt)在不同器官含量的測定

圖3 奧沙利鉑(Ⅱ)、M(Pt)對腫瘤體積的抑制效果

3 討 論

在化療藥物中，鉑配合物抗癌藥物在臨床上占有重要的地位，應用量大，約占全部抗癌藥物的一半以上〔14～16〕，在原有“高分子鍵合藥”前期工作的基礎上，研制雙親性嵌段共聚物與鉑(Ⅳ)的鍵合物，藥物含量達到臨床治療上的足夠高的鉑藥劑量，并有效降低了金屬鉑藥的毒性，在真正意義上實現對金屬奧沙利鉑(Ⅱ)藥物的有效保護和靶向輸送，為癌癥的檢測和治療開辟了新途徑〔17〕，鉑(Ⅳ)從高分子鍵合物上釋放和還原成奧沙利鉑(Ⅳ)的過程通過細胞和動物實驗證明納米鉑藥抗腫瘤效果優于奧沙利鉑(Ⅱ)，真正意義上為高分子-鉑(Ⅳ)鍵合藥的研究提供了理論基礎，為納米藥物的臨床應用提供可供參考的實驗依據，開創性地創造出了低毒高效鉑類抗癌藥物的新品種〔18～20〕。構建肝癌的動物模型的方法主要包括自發性、誘發性、移植性、人類肝癌的異種移植模型及轉基因動物肝癌模型，既往實驗采用的動物模型絕大多數為移植性模型，且多為異位的動物模型，原位模型極少，這與原位動物模型的構建困難有關，但異位動物模型實驗結果不完全可靠，并不能完全真實地反映疾病的病理改變及治療效果。本文構建的昆明鼠原位肝癌種植模型，在實踐上具有高度的臨床實用性和相關性，易于開展和普及，實驗周期短，造模成功率高，在進行抗腫瘤藥物治療過程中能更好地真實模擬肝癌在人體內的生物學特性及破壞行為，在臨床試驗研究中具有極大的應用價值。從仿生學的角度設計和制備可控的鉑類高分子納米藥物，該藥物具有和生物體內環境相應的大小、形態、表面性能的特點。M(Pt)藥物在肝臟組織中具有截留效應，在腫瘤組織中具有高通透性和滯留效應(EPR)〔21〕，確實提高了藥物在腫瘤部位的蓄積，膠束藥物可以有效發揮抗腫瘤作用及達到緩釋的效果，更長久地發揮抗腫瘤效果。

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〔2016-10-22修回〕

(編輯 王一涵)

R735.7

A

1005-9202(2017)21-5241-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.010

黑龍江省青年基金(No.QC2013C101)；佳木斯大學青年基金(No.Sq2013-023)

1 佳木斯大學附屬第一醫院消化一科

羅 蘭(1978-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事消化系統疾病研究。

侯 杰(1978-)，男，博士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事肝膽外科研究。