吲哚丁酸對核桃嫩枝扦插生根及內源激素變化的影響

劉 昊， 宋曉波， 周乃富， 馬慶國， 裴 東

（1.中國林業科學研究院 林業研究所 國家林業局林木培育重點實驗室，北京100091；2.中國林業科學研究院林木遺傳育種國家重點實驗室，北京100091）

吲哚丁酸對核桃嫩枝扦插生根及內源激素變化的影響

劉 昊1,2， 宋曉波1,2， 周乃富1,2， 馬慶國1,2， 裴 東1,2

（1.中國林業科學研究院 林業研究所 國家林業局林木培育重點實驗室，北京100091；2.中國林業科學研究院林木遺傳育種國家重點實驗室，北京100091）

植物激素是調控不定根形成的重要因素。通過測定胡桃Juglans復幼嫩枝扦插過程內源激素的質量分數變化，分析植物生長調節劑誘導對內源激素的影響，為探討植物激素對不定根發生提供參考。以胡桃品種 ‘中寧盛’‘Zhongningsheng’復幼插穗為試驗材料，利用高效液相色譜串聯質譜法，測定外源吲哚丁酸（IBA）誘導處理下插穗基部內源激素變化，并統計生根情況。結果表明：外源IBA誘導處理對插穗生根影響顯著。經IBA誘導的嫩枝插穗生根率高達98.1%，對照處理沒有生根，死亡率達75.5%；發根過程經歷了形成層增厚、分生組織細胞團產生、根原基初始細胞發生、根原基形成和根的發育等階段，外部形態表現為增粗、開裂；與對照組相比，扦插后內源激素變化明顯，吲哚乙酸（IAA）先升高，并于第5天達到峰值，之后降低；赤霉素（GA3）變化趨勢與IAA一致；脫落酸 （ABA）則是先降低后上升；玉米素（ZT）前期沒有明顯變化，根原基誘導后明顯升高。外源生長素的誘導提高了嫩枝插穗IAA的水平，改變了內源激素質量分數，促進了不定根的形成。圖4表1參23

植物學；核桃；嫩枝扦插；不定根；高效液相色譜串聯質譜法；植物激素

扦插是目前繁育無性系砧木的常用方式，效率高，成本低，且能保持砧木的優良性狀。對于難生根樹種的無性繁殖，扦插時往往需使用植物生長調節劑進行誘導；研究發現生長素處理插穗可誘生根原基進而誘導扦插枝條生根［1-2］。生長素類物質，如吲哚丁酸（IBA）和萘乙酸（NAA），外施于插穗基部時能夠明顯提高不定根的發生率［3-4］，顯著影響和改變內源生長素水平；激素水平是影響扦插不定根發生的重要因素［5-6］，內源激素的含量變化，會刺激不定根發生的啟動。胡桃Juglans又名核桃，其屬植物普遍難生根，復幼處理可以使插穗具備生根能力，但在扦插時還必須施加外源生長素方能生根［7］。本試驗以經復幼處理的核桃品種 ‘中寧盛’ ‘Zhongningsheng’嫩枝插穗為試材，分析施加IBA處理對插條生根的影響，測定扦插生根過程中插穗基部的內源激素變化，初步探討內源激素動態變化及相互作用與不定根形成的關系，為研究核桃嫩枝扦插繁殖和生根生理機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為經復幼處理的核桃品種 ‘中寧盛’半木質化嫩枝插穗，要求長勢一致、無病蟲害。

參考宋曉波［8］方法，試驗組用5.0 g·L-1的IBA溶液速蘸插穗基部10 s，對照組以清水速蘸，扦插枝條 50 根·處理-1， 并重復 3 次。 扦插基質以 V（黃土）∶V（牛糞）∶V（河沙）＝1∶1∶1 配置混合， 扦插前 5 d 裝入營養缽，并用質量濃度為0.5%的高錳酸鉀噴淋消毒后備用。插穗制備好后放置數分鐘待基部表面溶液揮發后，豎直插于營養缽中，深度5 cm。扦插后澆水，并隔7 d噴灑質量濃度為 1.0 g·L-1的高錳酸鉀溶液消毒。保持扦插環境溫度為18～35℃，相對濕度70%以上。

扦插前 0 d和扦插后 1，3，5，7，9 d隨機采集插穗，3條·處理-1，重復3次，共取樣6次。迅速用蒸餾水將插穗基部沖洗干凈并用濾紙擦干，迅速截取穗條基部底端莖段約 1 cm，用錫紙包裹放入液氮冷凍保存。樣品轉移至實驗室后，加入液氮快速研磨并冷凍干燥，-80℃下保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 生根率測定 扦插后，1次·d-1觀察插穗形態變化，拍照，記錄生根進程。扦插至20 d時，檢測插穗的生根數量和生根情況，統計生根率。

1.2.2 組織結構觀察 扦插后每隔1 d取樣，重復3次，共取樣8次。截取插穗基部1 cm長的莖段用甲醛-醋酸-乙醇固定液（FAA）固定，參照葉寶興等［9］的方法并作改動，制作石蠟切片。番紅固綠染色，加拿大樹膠封片，OLYMPUS光學顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 插穗內源激素質量分數測定 采用高效液相色譜-四級桿離子阱串聯質譜儀（HPLC-MS/MS QTRAP）測定。內源激素提取參照賈鵬禹等［10］方法略作改動，稱取凍干粉 0.1 g·樣本-1，萃取獲得上清液用于激素質量分數（鮮質量）測定。數據用Analyst 1.5數據處理軟件（美國Applied Biosystem公司）處理與分析。

1.3 數據處理

應用Excel 2007軟件進行數據整理和繪圖，使用SPSS 18.0軟件進行t檢驗分析。激素檢測值以取平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 施加IBA對核桃復幼插穗生根效果的影響

扦插20 d后，測量核桃復幼插穗生根情況。由表1可知：試驗組生根率高達98.1%，對照完全沒有生根，且大部分死亡。說明有無IBA處理，切口愈傷率、植株死亡率和插穗的生根率差異顯著。

2.2 生根進程觀察

2.2.1 插穗基部形態變化 扦插后3 d，插穗基部部分表皮褐化（圖1A）；扦插后5 d，試驗組部分插穗基部膨大，個別皮孔有外凸甚至開裂跡象（圖1B）；扦插后7 d至9 d，試驗組插穗基部膨大，切口附近沿莖開裂，開口處有白色絮狀組織，不定根開始發生（圖1C）；扦插至15 d時，不定根突破表皮，開始伸長生長（圖1D）。對照組插穗扦插至15 d時，插穗基部表皮褐化，未生根。

表1 IBA處理對核桃嫩枝扦插生根的影響Table 1 Effects of IBA on the rooting of walnut soft-wood cuttings

圖1 核桃嫩枝生根過程中插穗基部形態變化Figure 1 Morphological changes of the soft-wood cuttings base during walnut rooting

2.2.2 插穗基部解剖結構變化 相比于對照，經IBA誘導的嫩枝插穗基部組織結構變化明顯。圖2為試驗組插穗基部橫切片，可以發現扦插后3 d，插穗基部形成層開始迅速分裂，并明顯增厚（圖2A）；扦插后5 d，部分增厚的形成層細胞進一步發育，在韌皮部形成團狀的分生組織（圖2B）；扦插至7 d時，根原基分生組織進一步分裂分化成初始根原基細胞（圖2C），扦插至9 d時，初始根原基細胞在韌皮部發育為圓頂狀的根原基（圖2D）；至扦插15 d時，不定根形成并突破表皮（圖2E）。

圖2 核桃嫩枝生根過程中插穗基部解剖結構變化Figure 2 Anatomical structure changes of the soft-wood cuttings base during walnut rooting

2.3 生根過程中插穗內源激素的動態變化

2.3.1 吲哚乙酸（IAA）的動態變化 嫩枝扦插后插穗中IAA質量分數迅速上升。由圖3A可知：對照組在1 d時，IAA質量分數達到峰值，為857.0 ng·g-1，此后下降。試驗組IAA質量分數在扦插5 d時升到峰值，為1 395.0 ng·g-1；此時，插穗基部增粗，出現開裂，說明誘導不定根原基生成。

2.3.2 脫落酸（ABA）的動態變化 嫩枝扦插后插穗中ABA質量分數變化如圖3B所示。扦插后插穗的內源ABA質量分數迅速下降，但對照組在3 d時開始回升，并在之后一直保持上升趨勢；試驗組則持續下降，至5 d時達到最低之后迅速上升，并在7 d時達到峰值56.6 ng·g-1，至9 d后逐漸下降。

2.3.3 赤霉素（GA3）的動態變化 扦插后7 d插穗的內源GA3質量分數變化趨勢大體呈 “升高—降低”趨勢（圖3C），并在5 d時達到峰值，試驗組最高為17.1 ng·g-1，對照組最高為11.1 ng·g-1。不同的是試驗組在7 d后GA3質量分數再次上升，而對照則持續下降。

2.3.4 玉米素（ZT）的動態變化 ZT質量分數的變化圖3D所示。扦插后3 d，試驗組和對照組內源ZT質量分數變化不明顯；3 d后試驗組ZT質量分數開始上升，9 d時達到298.5 ng·g-1，而對照組一直無明顯變化，只在7 d后略微升高，9 d時僅達到30.9 ng·g-1。

圖3 核桃嫩枝生根過程中插穗內源激素質量分數變化Figure 3 Dynamic changes of endogenous hormonesin the rooting process of walnut soft-wood cuttings

2.3.5 插條生根過程wIAA/wABA的動態變化 由圖4A可知：試驗組wIAA/wABA比值在扦插后升高，至5 d時達129.1，之后急劇下降，但7 d后又緩慢上升；對照組wIAA/wABA比值在扦插后1 d時達到最高值為43.5，而后持續下降。

2.3.6 插條生根過程wIAA/wGA3的動態變化 由圖4B可知：試驗組wIAA/wGA3比值呈現 “M”型變化趨勢，并在3 d時達第1個峰值為103.9，7 d達第2個峰值為108.5。與試驗組相比，對照組wIAA/wGA3比值在扦插后1 d時達到最高值為119.7，此后迅速下降，至3 d時后下降速度放緩。

2.3.7 插條生根過程中wIAA/wZT變化動態 從圖4C可以看出：試驗組wIAA/wZT呈現先升高后降低變化趨勢，扦插后3 d時wIAA/wZT達峰值為60.1，之后至9 d時持續下降。對照組wIAA/wZT比值也呈現同樣的變化趨勢，不同之處在扦插后1 d時即達到峰值42.4，后轉為下降。

3 結論與討論

外源生長素的誘導可以調節內源激素的水平，間接影響不定根的形成及根系的形成和發育［11-12］；而內源激素水平的高低則直接與插穗生根能力密切相關［13］，同時多激素的相互作用也是調控生根的關鍵［14］。核桃是難生根樹種，早先研究表明：核桃成齡嫩枝扦插幾乎不能生根［7-8］。本研究以經過復幼處理的嫩枝為試材，用外源IBA誘導其生根，發現不定根發生率達到98.1%，而對照生根率為0，表明外源生長素的誘導對核桃嫩枝發根至關重要。

圖4 核桃嫩枝生根過程中插穗內源激素比值的變化Figure 4 Change of the endogenous hormone ratio during rooting process of walnut soft-wood cuttings

大量試驗表明：生長素是促進不定根發生的主要因素［15-17］，生長素峰值的出現往往會誘導根原基的發生［16］。本研究結果發現：外源IBA誘導下的插穗在扦插5 d后IAA鮮質量分數出現高峰（圖3A），結合顯微觀察發現5 d時根分生組織發生（圖2B），7 d時初始根原基細胞團形成（圖2C），9 d時不定根原基產生（圖2D），說明施加外源生長素明顯提高了內源IAA的水平，從而促進了不定根原基細胞的形成。

脫落酸通常被認為是不定根發生的抑制劑［18］，其調控不定根的發生是通過與IAA的平衡共同起作用，較高的wIAA/wABA能促進不定根的形成［19］。本研究發現無論試驗組對照組，受切傷和水分脅迫所致，扦插初期插穗ABA水平較高，扦插后迅速下降，根原基產生后又有所升高；wIAA/wABA峰值出現在根原基發生階段，說明相對較低水平的脫落酸可以促進不定根的形成。

有研究認為：較高水平內源赤霉素對不定根發生有抑制作用［20］，赤霉素高表達后可通過影響生長素的運輸而抑制不定根發生［21］。本研究發現：IBA誘導后的插穗自扦插伊始至根原基產生，期間GA3與IAA呈協同上升的趨勢，第3天時達到第1個峰值，此時形成層開始增厚（圖2A），第7天達第2峰值，此時根原基初始細胞開始生長（圖2C）；同時發現兩者的比值在不定根發生階段始終高于對照組（圖3C，圖4D）；由此認為核桃復幼插穗中相對較高水平的wIAA/wGA3，可能在不定根形成前期有利于形成層增厚和脫分化，而在后期對不定根原基的細胞生長有促進作用。

關于ZT等細胞分裂素對植物不定根形成的影響，有研究認為其主要作用是抑制根原基的分化和形成，同時促進不定根的發育［22］。細胞分裂素的作用主要是調控生長素的變化；較高水平的細胞分裂素能抑制生長素極性運輸載體PIN1的表達［23］。因此認為當ZT水平較高時，wIAA/wZT比值上升促進不定根原基的發生。本研究發現：經IBA誘導的插穗在扦插前期ZT質量分數相對較低，根原基開始產生后則迅速上升，與對照組差異顯著；wIAA/wZT比值前高后低，至第3天達到高峰，此時正是形成層分裂增厚時期。該結果表明：核桃復幼插穗中ZT質量分數較低，外源生長素的誘導可能對ZT的影響不明顯，高比值的wIAA/wZT與形成層分裂有關；而根原基發生后ZT明顯增加，此時wIAA/wZT降低，說明比值下降對根的分化和發育起著促進作用。

綜上所述，施加外源吲哚丁酸可以誘導核桃復幼嫩枝不定根的發生，同時改變了內源激素的含量。然而，關于外源生長素改變內源激素含量及內源激素對生根的作用機制，還有待進一步的探索和研究。

［1］ 王紫陽，徐建華，李火根，等.中山杉優良無性系302，118，405扦插生根能力比較［J］.浙江農林大學學報，2015， 32（4）： 648-654.WANG Ziyang,XU Jianhua,LI Huogen,et al.Rooting capabilities for Taxodium ‘Zhongshanshan’ 302,118,and 405 ［J］.J Zhejiang Aamp;F Univ,2015,32（4）:648-654.

［2］ 白磊，李榮生，尹光天，等.米老排扦插生根因子及優化［J］.浙江農林大學學報，2016，33（3）：543-550.BAI Lei,LI Rongsheng,YIN Guangtian,et al.Rooting factors and optimization for propagation of Mytilaria laosensis cuttings ［J］.J Zhejiang Aamp;F Univ,2016,33（3）:543-550.

［3］ 董寧光，齊建勛，陳永浩，等.沙藏埋枝處理對促進平歐雜種榛綠枝扦插生根的機制分析［J］.果樹學報，2016， 33（12）： 1510-1516.DONG Ningguang,QI Jianxun,CHEN Yonghao,et al.Physiological and biochemical basis of hazelnut rhizogenesis promoted by embedded stock etiolation ［J］.J Fruit Sci,2016,33（12）:1510-1516.

［4］ SWAMY S L,PURI S,SINGH A K.Effect of auxins （IBA and NAA） and season on rooting of juvenile and mature hardwood cuttings of Robinia pseudoacacia and Grewia optiva ［J］.New For,2002,23（2）:143-157.

［5］ NEGISHI N,NAKAHAMA K,URATA N,et al.Hormone level analysis on adventitious root formation in Eucalyptus globules ［J］.New For,2014,45（4）:577-587.

［6］ 吳文浩，曹凡，劉壯壯，等.NAA對薄殼山核桃扦插生根過程中內源激素含量變化的影響［J］.南京林業大學學報（自然科學版）， 2016， 40（5）： 191-196.WU Wenhao,CAO Fan,LIU Zhuangzhuang,et al.Effects of NAA treatment on the endogenous hormone changes in cuttings of Carya illinoinensis during rooting ［J］.J Nanjing For Univ Nat Sci Ed,2016,40（5）:191-196.

［7］ 裴東.核桃等樹種不定根發生及其無性繁殖［M］.北京：中國環境科學出版社，2009.

［8］ 宋曉波.復幼提高核桃不定根發生能力的多基因作用機制［D］.北京：北京林業大學，2016.SONG Xiaobo.Role of Multi-genes during Rooting Promoting by Rejuvenation in the Adventitious Rooting of Walnut［D］.Beijing:Beijing Forestry University,2016.

［9］ 葉寶興，畢建杰，孫印石.植物組織與細胞研究方法［M］.北京：化學工業出版社，2011.

［10］ 賈鵬禹，曾明飛，馮乃杰，等.在線固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測大豆不同部位的4種植物激素［J］.分析化學， 2014， 42（12）： 1743-1749.JIA Pengyu,ZENG Mingfei,FENG Naijie,et al.An automated dual-gradient liquid chromatography MS/MS method for simultaneous determination of four kinds of plants hormones in different parts of soya beans and its application to a real analysis ［J］.Chin J Analyt Chem,2014,42（12）:1743-1749.

［11］ HENRIQUE A,CAMPINHOS E N,ONO E O,et al.Effect of plant growth regulators in the rooting of Pinus cuttings［J］.Braz Arch Biol Technol,2006,49（2）:189-196.

［12］ OUYANG Fangqun,WANG Junhui,LI Yue.Effects of cutting size and exogenous hormone treatment on rooting of shoot cuttings in Norway spruce ［Picea abies,（L.） Karst.］ ［J］.New For,2015,46（1）:91-105.

［13］ NORDSTR?M A C,ELIASSON L.Levels of endogenous indole-3-acetic acid and indole-3-acetylaspartic acid during adventitious root formation in pea cuttings ［J］.Physiol Plant,1991,82（4）:599-605.

［14］ WOLTERS H,JüRGENS G.Survival of the flexible:hormonal growth control and adaptation in plant development［J］.Nat Rev Genet,2009,10（5）:305-317.

［15］ SAINI S,SHARMA I,KAUR N,et al.Auxin:a master regulator in plant root development［J］.Plant Cell Rep,2013,32（6）:741-757.

［16］ PACURAR D I,PERRONE I,BELLINI C.Auxin is a central player in the hormone cross-talks that control adventitious rooting ［J］.Physiol Plant,2014,151（1）:83-96.

［17］ de ALMEIDA M R,de BASTIANI D,GAETA M L,et al.Comparative transcriptional analysis provides new insights into the molecular basis of adventitious rooting recalcitrance in Eucalyptus ［J］.Plant Sci,2015,239（7）:155-165.

［18］ STEFFENS B,WANG J X,SAUTER M.Interactions between ethylene,gibberellin and abscisic acid regulate emergence and growth rate of adventitious roots in deepwater rice ［J］.Planta,2006,223（3）:604-612.

［19］ DAVIES P J.The plant hormones:their nature,occurrence,and functions ［G］//DAVIES P J.Plant Hormones.［s.l.］:Springer Netherlands,2010:1-12.

［20］ BUSOV V,MEILAN R,PEARCE D W,et al.Transgenic modification of gai or rgl1 causes dwarfing and alters gibberellins,root growth,and metabolite profiles in Populus ［J］.Planta,2006,224（2）:288-299.

［21］ MAURIAT M,PETTERLE A,BELLINI C,et al.Gibberellins inhibit adventitious rooting in hybrid aspen and Arabidopsis by affecting auxin transport［J］.Plant J Cell Mol Biol,2014,78（3）:372-384.

［22］ LAPLAZE L,BENKOVA E,CASIMIRO I,et al.Cytokinins act directly on lateral root founder cells to inhibit root initiation ［J］.Plant Cell,2007,19（12）:3889-3900.

［23］MARHAV＇Y P,DUCLERCQ J,WELLER B,et al.Cytokinin controls polarity of PIN1-dependent auxin transport during lateral root organogenesis ［J］.Curr Biol,2014,24（9）:1031-1037.

Adventitious root formation with IBA and endogenous hormones dynamics in walnut soft-cuttings

LIU Hao1,2,SONG Xiaobo1,2,ZHOU Naifu1,2,MA Qingguo1,2,PEI Dong1,2
（1.State Forestry Administration Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation,Research Institute of Forestry,Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091,China;2.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091,China）

Phytohormones are an important factor in regulating adventitious root formation.To provide a reference for discussing the role of phytohormones on adventitious root formation in walnut,the effect of exogenous hormones on endogenous hormones was analyzed by measuring the level of endogenous hormones during the cutting process of a rejuvenated softwood,Juglans （walnut） ‘Zhongningsheng’.The rejuvenated softwood was first induced by exogenous indole-3-butyric acid（IBA）and then,using High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry （HPLC-MS）,the endogenous hormones:Indole-3-acetic acid （IAA）,Gibberellic acid（GA3）,Abscisic Acid （ABA）,and Zeatin （ZT）;basal segments of soft-cuttings were measured followed by measurement of the rooting situation,student’s test were used for the treatment of the data.Results showed strong differences between samples induced and not induced by IBA.The rooting rate of rejuvenated softwood induced by IBA was up to 98.1%;whereas,in the control the rooting rate was 0 and the mortality rate was 75.5%.The rooting process experienced several stages,such as thickening of the cambium,meristem cell formation,root primordia initial cell formation,root primordia formation,and root development through observation of the anatomic structure.Additionally,the external morphology showed thickening and cracking.During soft-wood cutting,endogenous hormone levels in rejuvenated soft shoots induced by IBA changed noticeably.Also,IAA increased first and reached its peak at day 5,then decreased as did GA3.However,ABA decreased first and then increased.In the early stages,ZT changed little but did increase after root primordia induction.The level of IAA in softwood induced by IBA improved;however,the effects on ZT were small.So the changes of endogenous hormones induced by IBA promoted adventitious root formation. ［Ch,4 fig.1 tab.23 ref.］

botany;walnut;softwood cutting;adventitious root;HPLC-MS;phytohormones

S718.4

A

2095-0756（2017）06-1038-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.06.010

2017-02-10；

2017-03-29

國家林業公益性行業科研專項（201304712）；國家自然科學基金資助項目（31672126）

劉昊，博士研究生，從事經濟林生物技術研究。E-mail：glkl@163.com。通信作者：裴東，研究員，博士，從事經濟林學研究。E-mail：peigu@caf.ac.cn