降解聯苯菊酯微生物菌劑的制備及其穩定性測定

胡桂萍　石旭平　管幫富　張國彪　賀望興　曹揮華　龐博

摘要：為篩選適宜降解聯苯菊酯降解菌，采用正交試驗對克雷伯氏菌LB-1固體發酵基質進行篩選，在篩選結果的基礎上，對LB-1固體發酵條件、儲藏條件進行優化，并進行菌劑穩定性測定。結果表明，最佳載體配比為豆餅粉 ∶凹凸棒（90 ∶10）+10%麥麩+7%玉米粉+3%茶渣；菌劑LB-1制備的最佳接種量為15%，最適發酵溫度為 30 ℃，最適發酵時間為30 h，最適烘干時間為36 h，此時菌劑的有效活菌數和降解率均最高。同時菌劑在避光、溫度不高于25 ℃條件下90 d內可以保持較高降解活性。聯苯菊酯微生物菌劑LB-1在優化后固體發酵培養基培養后降解性和穩定性高，可為今后產品的商品化奠定基礎。

關鍵詞：克雷伯氏菌；農藥降解；聯苯菊酯；固體發酵

中圖分類號： S481+.8 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0257-04

收稿日期：2016-04-29

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：20151BBA13042）；公益性行業（農業）科研專項（編號：201303094-08）。

通信作者：胡桂萍（1985—），女，福建龍巖人，博士研究生，助理研究員，研究方向為茶葉副產物資源化開發與利用和茶葉植保。E-mail：hugp__2007@163.com。 目前，以綠色、環保、有效為宗旨的農業污染微生物修復，在農業可持續發展生產中起著越來越重要的作用。國內外學者，對于農業環境中的污染物，如重金屬、農藥殘留、稀土等開展大量微生物修復研究，已獲得數百種具有降污效能的功能微生物，對其作用機制也已得到廣泛深入的研究和報道，但是對其規模化生產的應用技術相關報道較少，主要是由于缺乏成熟經濟的發酵生產工藝。目前，微生物降污劑、農殘降解劑、重金屬修復劑通常采用液體發酵報道居多，固體發酵報道較少。其中，液體發酵設備要求高、周期短、發酵產物活性強，但成本較高、產品穩定性較差、不易保存；而固體發酵雖產地需求大，發酵周期長，但其發酵材料來源豐富，可以以大量農作物廢棄物作為優良的固體培養基，具有生產成本低廉的特點，發酵產品具有易保存及運輸等優點[1]，因此固體發酵是未來重要的生物修復劑等功能微生物產業化的技術。一般而言，菌劑的穩定性包括從制備到使用期間活菌數的變化速度和程度，這是評價菌劑質量的重要參數[2]，而對于降污劑菌制劑通常則以有效活菌數和降解效能為衡量發酵優劣的核心指標[3]。研究表明，在固體發酵過程中，除了溫度、含水量、pH值、傳質等因素對發酵質量關系密切[4-6]，基質特性也對微生物固體發酵的質量和產量起關鍵作用[7]。微生物固體發酵的基質組成結構，不僅關系微生物在發酵過程中供給的養分狀況，其顆粒大小等直接影響到微生物發酵過程中氧氣的供給速度和水分含量[8]。對功能微生物發酵成分和發酵條件的優化不僅可以減少發酵成本，而且可提高發酵產物的數量和質量，使得功能微生物的研究不局限于理論研究，加速其應用推廣。

微生物降解菌對環境中的污染物、有毒有害物質均有很好的修復和改良作用，具有很好的應用前景。但是，目前微生物降解菌主要局限于菌種生物特性和降解特性及機理方面，而在實踐中應用的案例鮮見報道，缺少切實可行的發酵技術。因此，本研究根據前期研究結果獲得聯苯菊酯降解菌，克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）LB-1[9]，從聯苯菊酯降解菌株實際應用方面出發，使用廉價農產品原料和農業副產物，豆餅粉、麥麩、玉米粉并首次添加茶渣作為發酵基質進行菌株固體型菌劑制備材料及保存條件進行研究，從而為聯苯菊酯降解菌克雷伯氏菌LB-1產業化應用提供理論參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株LB-1為克雷伯氏菌，保存于江西省蠶桑茶葉研究所微生物菌種庫。

1.2 藥品和試劑

聯苯菊酯標準品：純度99.8%（由福建省農業廳農產品質量檢測中心提供），丙酮、石油醚、無水硫酸鈉。

1.3 培養基

LB培養基[10]：10.0 g蛋白胨；5.0 g酵母提取物；10.0 g NaCl，加水定容至1 L，pH值為7.0～7.2。配制相應的固體培養基須加入1.5%瓊脂粉。

基礎無機鹽（MSM）培養基[11-12]：1.5 g Na2HPO4·12H2O，1.5 g KH2PO4，1.0 g NH4NO3，0.2 g MgSO4·7H2O，0.01 g CaCl2·2H2O，0.001 g FeSO4·7H2O，0.050 g酵母提取物，加蒸餾水定容至1 L，pH值7.0～7.2。

1.4 不同混合載體的篩選

將麥麩、鋸末、茶渣、玉米粉、豆餅粉按一定比例（質量百分比）配成混合載體，121 ℃滅菌2 h，冷卻后按1 ∶1（體積比）接種LB-1種子液。25 ℃通風發酵培養24 h，通風烘干48 h，研成粉末，定時取樣測定。結果用有效菌數表示，確定最佳混合載體配方組成。

1.5 載體組合優化

以凹凸棒土和豆餅粉混合物為載體基料，分別以麥麩、茶渣、玉米粉作為添料按照質量比添加到基料中，混合后，121 ℃ 滅菌2 h，冷卻后按照體積比（1 ∶1）的量接種LB-1種子液。25 ℃通風發酵培養36 h，后烘干30 h，研成粉末，定時取樣測定。通過4因素3水平進行優化載體最佳組合配比（表1），結果用有效活菌數和降解率共同表示。

1.6 菌劑制備工藝條件優化

以優化后的載體組合進行菌劑制備最佳工藝條件優化，分別通過單因素試驗分析接種量（10%、15%、20%、25%、30%）、發酵溫度（20、25、30、35、40 ℃）、發酵時間（18、24、30、36、42、48 h）、烘干時間（10、15、20、25、30 h）對菌劑有效活菌數和降解率的影響。endprint

1.7 菌劑儲藏條件的優化

比較菌制劑分別在有光（透明玻璃瓶）、黑暗避光（避光棕色玻璃瓶）以及在不同儲藏溫度下放置30 d后的有效活菌數和降解率。

1.8 菌劑穩定性驗證

將制備好的菌劑分別在室溫25 ℃條件下保存，分別在處理后10、30、45、60、75、90、105、120 d取樣測定有效活菌數和降解率，檢測菌劑的穩定性。

1.9 有效活菌數檢測方法

有效活菌數采用菌落計數方法，采用稀釋平板涂布法，每個稀釋度做3個重復，培養基為LB培養基，25 ℃培養24 h，進行菌落計數。

1.10 降解率測定方法

菌劑對聯苯菊酯降解率的測定參照胡桂萍等方法[13]，挑取菌落計數后平板上的單菌落在LB培養基中活化24 h，然后用緩沖液清洗，制備菌懸液。然后按照10%的接種量，接入含有50 mg/mL的聯苯菊酯無機鹽培養基中，150 r/min培養96 h后取30 mL添加農藥的培養液，分別加入60 mL丙酮，采用超聲波提取法提取（2×15 min）。提取液經鋪2層濾紙的布氏漏斗減壓抽濾，將濾液全部移入500 mL分液漏斗，加入60 mL石油醚，搖勻，振蕩30 min，靜置，分層，棄下層溶液，取石油醚層溶液，用20 g無水硫酸鈉過濾至250 mL圓底燒瓶。分液漏斗和無水硫酸鈉用45 mL石油醚分3次洗滌，洗液并入燒瓶濾液中，50 ℃恒溫濃縮，將濃縮液全部轉入 10 mL 刻度試管，并用3 mL石油醚分3次洗滌圓底燒瓶，定容至5 mL，取2 mL經0.45 μm有機膜注射式過濾器過濾，濾液收集于試管中，以供GC檢測。

氣相色譜條件：Agilent 6890N（μECD檢測器），毛細管柱HP-5，5% Phenyl methyl Siloxane，30.0 m×320 μm×0.25 μm。程序升溫：柱箱溫度初始80 ℃，保持1 min，運行時間為1 min，第一階段以10 ℃/min升溫到140 ℃，保持 1.000 min，運行時間為8.000 min，第二階段以20 ℃/min升溫到280 ℃，保持18.000 min，運行時間為33.000 min。進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度330 ℃。載氣為高純氮氣 20.0 mL/min，不分流進樣，進樣量為1 μL。在此條件下測得聯苯菊酯2個異構體的保留時間分別為18.304 min。標準曲線y=26 404x-22 012，確定系數為R2=0.995。其中x為聯苯菊酯濃度，y為峰面積。采用外標法測定樣品中聯苯菊酯的含量，求出其降解率。

聯苯菊酯降解率=[1-（實測殘量/對照實測殘量）]×100%。

2 結果與分析

2.1 不同混合載體的篩選

由表2可知，不同混合載體的篩選結果，茶渣和麥麩等6種載體按照排列組合組成A～F共6組混合載體，利用稀釋平板涂布相同條件下測定有效活菌數，可見A組合有效活菌數最高，為42.65億CFU/g，所以采用A組合當中的豆餅粉、麥麩、茶渣、玉米粉、凹凸棒作為混合載體的組成成分。

2.2 載體配比對菌劑制備的影響

試驗采用正交試驗4因素3水平設計，以L9（34）為正交試驗方案，對選用的載體材料混合用量進行了優化，以1 ∶1（載體質量 ∶菌體質量）與發酵干料均勻混合制成小球狀，避光常溫（25 ℃）放置45 d后測定活菌生物量和存活率。以k值和R值進行統計學分析，k值大，表示在用一個因素中該水平對試驗結果影響大，反則小之。R值大，說明該因素對試驗結果影響大，反之小。結果（表3）表明，各因素的主次順序為豆餅粉 ∶凹凸棒>麥麩接種量>玉米粉接種量>茶渣接種量，最佳配方為A3B2C3D3，即豆餅粉 ∶凹凸棒（90 ∶10）+10%麥麩+7%玉米粉+3%茶渣。

2.3 菌劑最佳制備工藝條件

單因素分析菌劑制備工藝條件得到，菌劑有效活菌數隨著接種量增加而上升，菌劑降解率在接種量為15%時為最高，而大于15%的接種量反而使降解率降低（圖1）。發酵溫度選擇在30 ℃時菌體在載體中生長最旺盛，降解率也最高（圖2），溫度過高或者過低均會影響菌體的生長和降解率。發酵時間為30 h時，即可聞到一種甜醋味，此時的活菌數最高，降解率也最高（圖3），表明此時菌體生長已達到最大化，發酵時間過長容易導致菌體缺乏營養供給而細胞死亡，發酵時間不足則會使載體的吸菌量不夠，從而導致降解率低。制備好的菌劑選擇烘干時間36 h后粉碎，得到的菌劑細度好，活菌數量最高，降解率最高（圖4），烘干時間過短，菌劑的含水量大，不易保存，而烘干時間過長，會使菌體大量死亡，降解率變低。因此， 菌劑LB-1制備的最佳接種量為15%， 最適發酵溫度為30 ℃，最適發酵時間為30 h，最適烘干時間為36 h。

2.4 菌劑儲藏條件優化

將制備好的菌劑分別在透明玻璃瓶和避光棕色玻璃瓶中保存，25 ℃ 放置10 d后取出測定菌劑的有效活菌數和降解率得到（圖5），透明玻璃瓶下（光照）菌劑的降解率和有效活菌數明顯低于避光棕色玻璃瓶中菌劑。另外，將制備好的菌劑儲藏在不同溫度下，避光放置30 d后進行降解率和有效活菌數的測定（圖6），30 d后，儲藏溫度在0 ℃時，有效活菌數和降解率為最高；而儲藏溫度為0～25 ℃時，10 d后菌劑的有效活菌數高于88.00億CFU/g，降解率保持較高的活性，均高于70%；而當儲藏溫度高于25 ℃時，10 d后菌劑的有效活菌數和降解率明顯下降。上述試驗表明，在避光且儲藏溫度不高于25 ℃條件下，菌劑均可以保持較高的有效活菌數和降解活性。

2.5 菌劑穩定性測定

菌劑在黑暗、25 ℃下儲藏90 d，菌制劑均可以保持較高的有效活菌數和較高的降解率（圖7），有效活菌數均高于 70億CFU/g，降解率高于78%；當存放時間為105 d時，菌劑的有效活菌數開始下降，降解率也隨著下降；當存放時間為120 d時，菌劑的有效活菌數低于60億CFU/g，降解率也更低，約60%。說明該菌劑在儲藏時間不超過90 d時，穩定性好。endprint

3 討論

固體發酵技術是微生物實現環境降污和生物修復的重要工具，而發酵基質是固體發酵效果影響的重要因素之一，因此選擇生產效率高、功能作用性強的基質和載體是微生物固體發酵的重要前提[13-14]。良好的載體是保證菌株活力的有效措施，對陽光具有吸收和分散作用，可以保護菌制劑免受紫外光線的照射；對水分的吸附，可以一定程度上緩沖干燥的環境條件，適宜載體可以優化并穩定菌劑發揮效果的微生態環境。

本研究通過對現代發酵工業中常用的發酵基質和吸附劑，豆餅粉[15-16]、凹凸棒[17-18]、麥麩[19]、玉米粉[20]以及添加茶樹副產物茶渣，采用正交試驗優化LB-1固體發酵基質配方，其載體的最佳配比為 ∶豆餅粉 ∶凹凸棒（90 ∶10）+10%麥麩+7%玉米粉+3%茶渣。發酵基質中添加茶渣，一方面是LB-1菌株來源于茶園環境中，而添加茶渣可以優化發酵基質環境，使LB-1發酵環境與其原生境相仿，提高菌株的生長量；另一方面茶渣含有纖維素，多糖，鈣、鉀、鎂常見元素，鐵、銅、錳、鋅、硒等微量元素，以及多種維生素和礦物元素，是一種良好的微生物基質，有助于發酵菌株的快速生長。目前，農業副產物作為生物發酵基質可以有助于資源綜合開發利用。如羅洋等也利用農業副產物橘皮與麥麩進行里氏木霉FS10-C固體發酵[21]。本研究中發酵基質以凹凸棒作為載體，不僅降低制作成本，制作工藝簡單，而且極大提高了菌劑的存活率和儲藏期，為LB-1固體菌劑的實用生產應用奠定基礎。

除了發酵基質種類、基質配比外，菌株接種量、發酵時間、發酵溫度、烘干時間等均直接影響到固體發酵產物的數量和質量。本研究通過對固體發酵條件初步分析得到，菌劑 LB-1 制備的最佳接種量為15%，最適發酵溫度為30 ℃，最適發酵時間為30 h，最適烘干時間為36 h且分別在這些條件下菌劑的有效活菌數量和降解率均表現較高活性。同時，對于儲藏方式進行分析得到，制備好的菌制劑放置于避光條件，且溫度不高于25 ℃時，可以保證菌制劑具有良好的活性。另外，對菌制劑的穩定性進行分析，得到菌制劑在90 d內菌劑的質量較好，90 d后菌制劑的有效活菌數和降解率均明顯降低，但這與當前微生物肥料或者農藥大于6個月有效期還有差距[8]。這可能與菌制劑的含水量、載體種類和含量均有關系，因此，如何通過進一步優化制備工藝和調整發酵基質配方來提高菌制劑產品的質量和保質期是下一步研究重點。

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