豬肺炎支原體脂蛋白LppT的多克隆抗體制備及鑒定

劉威+袁芳艷+周丹娜+劉澤文+楊克禮+段正贏+郭銳+蔡行+肖少波+田永祥

摘要：試驗構建豬肺炎支原體重組表達質粒pET30a-LppT，通過快速定點突變試劑盒將LppT基因中513、945、1 860、2 547 bp處的A突變為G，使改造后的LppT基因能在大腸桿菌系統中正確表達，IPTG誘導重組蛋白的表達并進行了蛋白純化，純化的目的蛋白與佐劑混合、乳化制備免疫原，免疫新西蘭大白兔制備LppT蛋白多克隆抗體。SDS-PAGE 分析結果顯示，IPTG誘導表達后獲得1條特異性蛋白條帶，分子質量約為110 ku，與預期蛋白大小一致。可溶性分析結果表明目的蛋白以可溶形式表達于上清中，純化的蛋白經SDS-PAGE分離后，用制備的LppT多克隆抗體進行Western Blot檢測，結果表明制備的LppT多克隆抗體具有較強的特異性。

關鍵詞：豬肺炎支原體；脂蛋白；LppT；多克隆抗體

中圖分類號： S858.28 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0220-04

收稿日期：2016-05-27

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2016YFD0500906）；國家自然科學基金（編號：31502069、31170160）；湖北省農業科學院青年科學基金（編號：2015NKYJJ14）；湖北省農業科學院競爭性計劃項目（編號：2016jzxjh030）；湖北省農業科技創新中心資助項目（編號：2015-620-004-001）。

作者簡介：劉 威（1985—），男，湖北武漢人，博士，助理研究員，主要從事動物傳染病研究工作。E-mail：liuwei85@126.com。

通信作者：田永祥，研究員，主要從事家畜主要疫病生物制劑的研制及綜合防控技術研究。E-mail：tyxanbit@163.com。 豬支原體肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的，以豬咳嗽和氣喘為主要癥狀的慢性呼吸道傳染病[1]，具有慢性、接觸性、高傳染性、高發病率和低死亡率的特征。該病廣泛分布于世界各地，國外常被稱為豬地方流行性肺炎，而在我國常被稱為豬氣喘病（又稱喘氣病）[2]。

豬肺炎支原體感染導致豬的生長率下降12%～16%，飼料轉化率降低13%～22%，體質量相對減少10～25 kg，商品豬的出欄時間延遲10～30 d[3]；同時還破壞豬的支氣管和細支氣管纖毛，進而損傷阻擋病原微生物入侵的物理屏障，破壞豬的巨噬細胞，降低機體的免疫清除能力，導致免疫抑制[4]。因此，在臨床上豬肺炎支原體常常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬Ⅱ型圓環病毒、豬流感病毒、胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌等病原混合感染，增加了當前豬病診斷和預防控制的難度[5-6]。此外，由于豬肺炎支原體是缺少細胞壁的原核微生物，對常作用于細胞壁的抗生素（如β-內酰胺酶類抗生素等）不敏感，豬群一旦被豬肺炎支原體感染，控制和凈化將十分困難[7]。據初步統計，全球每年因豬肺炎支原體感染造成的直接經濟損失高達2億美元。可以說，豬肺炎支原體已成為當前嚴重影響養豬業經濟效益的重大疫病，被喻為影響養豬業經濟效益的“隱性殺手”。

在以前的研究中，筆者完成了Mhp168株以及體外傳代致弱株Mhp168-L的全基因組序列的測定[8]。通過Mhp強弱毒力菌株的比較基因組學分析，篩選出了330個遺傳變異位點，分布于123個基因中，進一步分析發現當前國際上報道的Mhp毒力基因（如：P97、P102、P146、P159、P216等）幾乎全包括在這123個基因中，其他基因多數功能未知，極可能還存在潛在的未知毒力基因[9]。其中MHP168_424編碼的氨基酸序列與M. conjunctivae的膜脂蛋白LppT相似度較高，且均含有1處典型的細菌脂蛋白信號肽區域。M. conjunctivae的LppT蛋白具有體外黏附羔羊關節滑膜細胞的能力，且抗LppT的抗體能有效阻斷M. conjunctivae與羔羊關節滑膜細胞的黏附[10]。因此，推測脂蛋白LppT很可能是豬肺炎支原體的一個毒力相關因子。為了進一步研究脂蛋白LppT的功能，本試驗擬獲得LppT的體外表達產物并制備抗LppT的多克隆抗體，為深入研究LppT的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及實驗動物 MHP168菌株，由江蘇省農業科學院獸醫研究所提供，筆者所在實驗室保存。原核表達質粒pET-30a（+）、大腸桿菌DH5α和BL21（DE3），由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫室保存。新西蘭大白兔，購自湖北省疫病預防控制中心。

1.1.2 主要試劑 質粒小量提取試劑盒購自TIANGEN公司；瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自Omega公司。DNA聚合酶、核酸內切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。六聯組氨酸純化鎳柱、山羊抗兔IgG、HRP-DAB底物顯色試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 分別通過SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測LppT基因的信號肽序列和跨膜區，結果顯示LppT不含有信號肽序列，但是存在1處跨膜區域，跨膜區域位于9～31位氨基酸。跨膜區的存在可能導致蛋白的不表達和少量表達，因此在設計引物時去掉了前31個氨基酸的跨膜區域。引物根據Mhp168株LppT基因的核苷酸序列設計（基因登錄號：ADQ90626.1）：上游引物LppT-F：5′-TTTGGATCCATGTCCCAAGCCGAAAAAT-3′，下游引物LppT-R：5′-TTTCTCGAGTTATTCCATATATTC GCT-3′。在上、下游引物中分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。endprint