超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測干果中16種真菌毒素

王玉嬌+聶繼云+閆震+李志霞+程楊+張曉男

摘 要 建立了同時檢測10種常見干果中16種真菌毒素的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。將干果可食部分加水勻漿，以10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液為提取劑，C18為凈化劑，使用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離樣品，在優(yōu)化的洗脫梯度和時間條件下，16種真菌毒素在8 min內(nèi)實現(xiàn)良好分離，檢出限為0.02～1.00 μg/L； 在線性范圍 （1～200 μg/L） 內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)R>0.9981，3個添加水平的平均回收率為70.48%～118.85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD） 為0.3%～11.9%。本方法經(jīng)濟、快速、簡單、高效，能夠滿足不同干果基質(zhì)中多種真菌毒素同時檢測要求。

1 引 言

我國是干果第一生產(chǎn)大國，主產(chǎn)干果有核桃 （Walnut）、板栗 （Chinese chestnut）、榛子 （Hazelnut）、松子 （Pine nut）、杏仁 （Almond）、無花果干 （Dried fig）、桂圓干 （Dried longan）、紅棗 （Chinese jujube）、葡萄干 （Raisin） 、柿餅 （Dried persimmon） 等。干果對人體生長發(fā)育、增強體質(zhì)、預(yù)防疾病有極好的功效[1，2]。干果生長成熟期（果殼裂開）、采后處理（去殼、清洗等）及儲藏過程中可能被產(chǎn)毒真菌侵染[3]。據(jù)歐盟食品和飼料快速預(yù)警體系 （The Rapid Alert System for Food and Feed， RASFF）的通報數(shù)據(jù)顯示，2008～2014年，在被通報的26種食品安全風(fēng)險因素中，真菌毒素通報數(shù)量始終在前三位，而堅果及其制品和種子類是被通報次數(shù)最多的食品種類[4，5]。在干果中檢出的真菌毒素主要有黃曲霉毒素 （Aflatoxin， AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）[6～8]、恩鐮孢菌素 （Enniatine， ENA、ENA1、ENB、ENB1）[8]、白僵菌素 （Beauvericin， BEA）[8]、交鏈孢酚 （Alternariol， AOH）[8]、交鏈孢酚單甲醚（Alternariolmonomethyl ether， AME）[7]、騰毒素（Tentoxin， TEN）[8]、赭曲霉素（Ochratoxin， OTA、OTB）[8～11]、玉米赤霉烯酮（Zearalenone， ZEA）[10～12]、T2毒素[12，13]等16種。我國食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)（GB2761 2017）對4種毒素（AFB1、OTA、T2和ZEA）作出了限量標(biāo)準(zhǔn)，但只有AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍包括干果產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定熟制堅果及籽類中AFB1含量低于5 μg/kg，杏仁、榛子中低于15 μg/kg[14，15]。

多種真菌毒素同時檢測方法包括樣品前處理和儀器分析兩大步，其中以快速（Quick）、簡單（Easy）、經(jīng)濟（Cheap）、高效（Effective）、穩(wěn)定（Rugged）、安全（Safe）得名的QuEChERS前處理方法，具有儀器設(shè)備簡單、處理步驟少、可實現(xiàn)多組分同時凈化等優(yōu)點，廣泛用于真菌毒素檢測[16，17]。本研究選擇該樣品前處理方法處理樣品。常用的儀器分析方法有氣相色譜（Gas chromatography， GC）[18]，液相色譜（Liquid chromatography， LC）[19，20]以及氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 （GCMS）[21]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 （LCMS）[22，23]等，其中超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry， UPLCMS/MS）能滿足多組分、高通量、快速定性和定量分析。

如今食品安全備受關(guān)注，而相關(guān)研究報道涵蓋的干果基質(zhì)和真菌毒素種類不全面，主要集中在核桃[6，9，12]、無花果干[9，12]、杏仁[10，11]中的黃曲霉毒素[6，9，11，12]、赭曲霉毒素[11～13]。如白春林等[6]對湖北省市售堅果及籽類中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2進(jìn)行了檢測分析，Trucksess等[9]對葡萄干、無花果中的AFB1、OTA進(jìn)行了檢測分析。現(xiàn)有的多種真菌毒素檢測方法適用的基質(zhì)一般為1～ 5種[10，11]，液相梯度洗脫時間在8 min以上[7，10，13]，如文獻(xiàn)[13]和[29]中建立的檢測方法分別在10 min內(nèi)實現(xiàn)10種毒素和11種毒素的同時檢測。本研究以我國主產(chǎn)的10種干果為基質(zhì)，通過對比4種提取劑的提取效果。選擇并優(yōu)化凈化劑用量和液相梯度洗脫條件，建立了干果中16種真菌毒素同時檢測的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLCMS/MS Xevo TQ， 美國Waters公司）； CF16RXII立式大容量高速離心機（日本Hitachi公司）； MilliQDirecet 8全自動超純水機（美國 Millipore 公司）； ACQUITY UPLC BEHC18色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美國 Waters 公司）； 九陽料理機（JYLC20， 中國九陽有限公司）。

甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸和檸檬酸（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）； C18（50 μm， 6 nm）、 PSA （40 μm， 100 g） （美國Varian 公司）； 無水MgSO4 （優(yōu)級純，天津市津科精細(xì)化工研究所）； NaCl （優(yōu)級純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）； 尼龍有機濾膜 （Nylon，美國FINE Scientific公司）； 黃曲霉毒素 （AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）、赭曲霉素 （OTA、OTB）、玉米赤霉烯酮、T2毒素、恩鐮孢菌素 （ENA、ENA1、ENB、ENB1）、白僵菌素、交鏈孢酚、交鏈孢酚單甲醚和騰毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，新加坡Pribolab公司）。endprint

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取1 mg標(biāo)準(zhǔn)品，ENA、ENA1、ENB、ENB1和BEA標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，其余毒素標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解，分別定容至5 mL，均配成200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液； 準(zhǔn)確吸取16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液各適量，以乙腈定容，得到10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，

用10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液和空白基質(zhì)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)液逐級稀釋成200、 100、 50、 20、 10、 5.0、 2.0和1.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 樣品前處理

取10種干果的可食部分100 g，按表1所示加水量勻漿處理； 準(zhǔn)確稱取一定量勻漿（表1）于50 mL離心管中，加入10 mL提取液，劇烈振蕩3 min； 加入NaCl（1 g）和無水MgSO4（4 g），劇烈振蕩1 min； 9000 r/min 離心5 min。吸取5 mL上清液于10 mL離心管，加入200 mg C18，渦旋1 min，靜置40 min，過0.22 μm有機濾膜后，待測。

2.4 添加回收實驗

以核桃空白基質(zhì)為代表，添加100 μg/L的16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，靜置1 h，按2.3節(jié)所述方法進(jìn)行前處理。

2.5 UPLCMS/MS條件

色譜條件： ACQUITY UPLC BEHC18色譜柱； 柱溫： 40℃； 流動相A為乙腈，B為含0.5%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液； 梯度洗脫程序： 0.0～1.0 min，5%A； 1.0～3.2 min，5%～50% A； 3.2～5.4 min，50%～95% A； 5.4～7.7 min，95% A； 7.7～8.0 min，95%～5% A。流速： 0.4 mL/min； 進(jìn)樣體積： 5 μL。

質(zhì)譜參數(shù)： 電噴霧離子源（ESI）； 掃描方式： 正負(fù)同時掃描； 毛細(xì)管電壓： 0.5 kV； 檢測方式： 多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）； 離子源溫度： 150℃； 去溶劑氣溫度： 400℃； 去溶劑氣： 氮氣，800 L/h； 錐孔氣： 氮氣，50 L/h。其它參數(shù)見表2。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取劑的選擇

如圖1所示，參考文獻(xiàn)[23]，通過添加回收實驗對比了0.1%甲酸乙腈溶液（a，酸性）、乙腈（b，中性）、乙腈水甲酸（79∶20∶1，V/V）混合溶液（c，酸性極性）和 10 mmol/L

圖1 16種真菌毒素經(jīng)4種提取劑提取的回收率

Fig.1 Recoveries of 16 kinds of mycotoxins by four kinds of extracting agents

1： AFB1， 2： AFG1， 3： AFB2， 4： AFG2， 5： OTB， 6： OTA， 7： T2， 8： ENB， 9： ENB1， 10： ENA， 11： BEA， 12： AOH， 13： ZEA， 14： AME， 15： TEN， 16： ENA1. a， 0.1% formic acid （FA）acetonitrile （ACN）； b， ACN； c， ACNwaterTA （79∶20∶1， V/V）； d， 10 mmol/L citric acid in ACN.

檸檬酸乙腈溶液（d，酸性）4種提取劑的提取效果。其中c組回收率在120.75%～183.75%之間，不能滿足檢測要求； 其余3組回收率在76.15%～124.30%之間，利用統(tǒng)計分析軟件SAS（STATISTICAL ANALYSIS SYSTEM）分析， b組和d組回收率方差呈現(xiàn)顯著差異，且前者方差大于后者，說明10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液提取的16種真菌毒素回收率更接近100%，因此棄用乙腈； 而a組和d組回收率方差無明顯差異，考慮到檸檬酸比甲酸更經(jīng)濟環(huán)保，因此選取10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液作為本研究方法的提取劑。

3.2 凈化劑選擇及用量

參考EN 15662[25]中的凈化方法，首先考察PSA和C18對16種真菌毒素的吸附情況，結(jié)果見圖2。OTB、OTA和AOH在3個PSA用量（低20 mg/mL、中50 mg/mL、高100 mg/mL）下的回收率都低于51.30%，表明PSA對OTB、OTA和AOH有強烈吸附； 而3個C18用量（低10 mg/mL、中30 mg/mL、高50 mg/mL）下16種真菌毒素平均回收率分別為90.58%、80.07%、76.43%，但C18用量為50 mg/mL時，BEA、ENA、ENA1、ENB和ENB1的回收率低于53.45%。采用50、100、150、200、300和450 mg C18添加量梯度做添加回收實驗，計算樣品基質(zhì)溶液的基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME（ME = B/A×100%，B為目標(biāo)化合物在空白基質(zhì)中的響應(yīng)值，A為目標(biāo)化合物在提取液中的響應(yīng)值））[26]，通過回收率和基質(zhì)效應(yīng)評價凈化效果[26]。由圖3A可見，C18添加量為150、200、300和450 mg時，16種毒素的回收率在75.60%～111.8%之間； C18添加量為200 mg時的基質(zhì)效應(yīng)在57.55%～116.44%之間（圖3B），利用SAS軟件分析200 mg C18添加量與其它3種添加量（150、300和450 mg）的基質(zhì)效應(yīng)方差差異性，結(jié)果200 mg添加量的基質(zhì)效應(yīng)方差小于其它3種添加量且差異極顯著，因此選擇添加200 mg的C18進(jìn)行凈化。但葡萄干、紅棗、柿餅等基質(zhì)中的色素不能被去除，有待進(jìn)一步優(yōu)化。

3.3 梯度洗脫時間和條件優(yōu)化

以乙腈（A）和含0.5%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液（B）為流動相，分別在8、10和15 min內(nèi)對16種真菌毒素總離子流進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)16種真菌毒素在8 min內(nèi)完全出峰。考察了3個梯度洗脫條件（表3）的效果，結(jié)果在2.5節(jié)所述梯度洗脫條件（表3a）下，16種真菌毒素（濃度200 μg/L）峰形最佳且分離良好（圖4）； 文獻(xiàn)[13]和文獻(xiàn)[28]中建立的檢測方法分別在10 min內(nèi)同時檢測10種毒素和11種毒素，文獻(xiàn)[29]建立的方法在7 min內(nèi)同時檢測14種毒素[13，27，29]，而本方法在8 min內(nèi)實現(xiàn)了16種真菌毒素同時檢測，與之前報道的同類方法相比，在更短的時間內(nèi)實現(xiàn)了更多真菌毒素同時檢測。endprint

3.4 線性范圍及檢出限

在2.5節(jié)所述條件下測定16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，以峰面積對各真菌毒素進(jìn)行線性回歸分析，以核桃空白基質(zhì)樣品為基質(zhì)，參考文獻(xiàn)[30]利用低濃度添加回收（0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.00、2.00和5.00 μg/L）得出方法檢出限和定量限。16種真菌毒素在1～200 μg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)大于0.9981，檢出限為0.02～1.00 μg/L，定量限為0.10～5.00 μg/L（表4），ENB、ENB1、ENA、ENA1、BEA的檢出限與文獻(xiàn)[8]一致，線性相關(guān)系數(shù)比文獻(xiàn)[8]略高，而黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）、赭曲霉毒素A、T2毒素和ZEA的檢出限比文獻(xiàn)[29]高，線性范圍窄于該文獻(xiàn)，但本研究同時檢測的真菌毒素種類更多，適用的基質(zhì)也更廣泛。

3.5 回收率和精密度

用10種干果空白基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，對線性范圍為1～20 μg/L的真菌毒素添加2、10和20 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對線性范圍在為5～200 μg/L的真菌毒素添加10、20和100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平進(jìn)行6次平行實驗，結(jié)果見表5。16種真菌毒素的平均回收率在70.48%～118.85%之間，RSD范圍為0.3%～11.9%，能夠滿足10種干果基質(zhì)中16種真菌毒素同時檢測的需要，且以核桃基質(zhì)為代表建立的前處理方法適用于其它9種基質(zhì)。

3.6 實際樣品分析

利用本方法對市售10種干果共30份樣品（每種干果3份樣品）進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，17份（核桃2份，板栗2份，榛子1份，松子2份，杏仁1份，無花果3份，桂圓2份，紅棗2份，柿餅2份）樣品被檢出含有真菌毒素。16種真菌毒素除了T2和BEA其它均有檢出，其余14種真菌毒素檢出值為黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）