基于新型介質阻擋放電離子源的藥物快速檢測方法研究

洪歡歡+趙鵬+寧錄勝+聞路紅+徐鐵峰

摘 要 本研究將單電極放電技術的DBDI與質譜（MS）聯用，快速檢測了4種低極性的合成藥物，結果表明， 4種合成藥物主要生成[M+H]+分子離子。此外還利用DBDIMS對草烏、制草烏切片進行快速分析，在草烏中檢測到烏頭堿、中烏頭堿、脫氧烏頭堿的[M+H]+離子，以及[M+H-60]+碎片離子； 在制草烏中只檢測到烏頭堿、中烏頭堿、脫氧烏頭堿的[M+H-60]+碎片離子。所測草烏中的標志性藥效成分主要為雙酯類生物堿，制草烏中的標志性藥效成分主要為單酯類生物堿。新型DBDI為藥物研究提供了一種新的、快速檢測方法，具有十分重要的理論和實際應用意義，在藥物研究領域具有極大的應用潛力。

1 引 言

敞開式質譜離子源技術是一種新型的、敞開式的、直接對樣品或樣品表面進行分析的質譜分析技術，廣泛應用于食品檢測、爆炸物分析、中草藥分析等多個領域[1～3]。經過多年的發展，常壓敞開式離子化技術的種類已超過了40種，并建立了各具特色的質譜分析方法。

介質阻擋放電（Dielectric barrier discharge， DBD），又稱無聲放電，是一種新型敞開式離子化技術[4]。2007年，Na等[5，6]提出了基于介質阻擋放電的離子源（Dielectric barrier discharge ionization， DBDI）。2008年，Harper等[7]在DBDI的基礎上，發展出低溫等離子體離子化方法（Lowtemperature plasma， LTP）。 2016年， 寧波大學聞路紅課題組提出一種穩定、高效的DBDI單電極放電技術，并基于該技術成功研制出新型介質阻擋放電離子源（DBDI）[8]，具有操作簡單、快捷、無需復雜的樣品前處理、可以與各種質譜儀器聯用等優點，同時兼具傳統質譜的高分析速度、高靈敏度等特點。

DBDI技術在食品安全[5]、爆炸物檢測[6]、環境污染物監控[9，10]等諸多領域已展現出廣泛的應用前景。DBDI可以離子化極性范圍更大的化合物，對ESI難電離的物質具有較高的靈敏度[11]，可用于合成藥物中極性范圍較大的主要藥效成分的檢測。 Liu等[12]將低溫等離子體（LTP）探針離子源和質譜聯用，對激素，解熱止痛劑，心血管等11種商業藥物進行檢測，實現藥物快速和高通量篩選； Hiraoka等[13]提出一種基于快速熱解析技術的DBDIMS方法，可有效實現氯雷他定、依替唑侖等多種難揮發和非揮發固態藥品檢測，檢測限可達ng級別； Zhang等[14]將毛細管電泳（CE）、表面等離子體共振（SPR）與DBDIMS在線組合，對含鹽溶液中的小分子藥物（醋氨酚、奎寧等）進行分析，發現DBDI對不揮發鹽表現出更高的耐受性，可應用于一些特殊條件下的研究。DBDI技術也適用于中草藥研究，解決傳統檢測技術存在用樣量大、樣品制備耗時等缺陷。如Smoluch等[15]基于熱輔助的DBDIMS分析技術對植物基質中8種合成大麻素進行分析，只需少量的樣品（約數百微克）即可實現“特制藥物”中大麻素類似物和衍生物的分析， 且無需樣品前處理和溶劑萃取。文獻[16，17]用LCMS方法檢測草烏與炮制品的主要藥效成分進行區分辨別，但檢測方法需要耗時較長的萃取和樣品制備過程。

本研究將基于單電極放電技術的新型DBDI與質譜（MS）聯用，對4種低極性的合成藥物和草烏、制草烏中標志性藥效成分進行快速分析，進一步探索新型DBDI在藥物研究領域中的應用價值。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

DBDI機箱、DBDI離子源（中國寧波華儀寧創智能科技有限公司）； 500質譜儀（美國Varian公司）； LTQ質譜儀（美國賽默飛公司）； 微電極玻璃毛細管（中國武漢微探科學儀器有限公司，Glass capillaries， B10024F，外徑1 mm，內徑0.59 mm，長度100 mm）。

甲醇（質譜級99.99%，上海安普實驗科技股份有限公司）； 氦氣（99.99%，寧波百方氣體有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品制備 MCT3IM2、MCT2PBD、MCTIME、MCTIMA由北京某藥廠合成，分別用甲醇溶解，配制成50 mg/L的標準溶液； 烏頭堿（Aconitine， AC）、中烏頭堿（Mesaconitine， MA）標準品（Sigma Aldrich公司）分別用甲醇溶解，配制成20 mg/L的標準溶液； 生草烏、制草烏購自寧波市中草藥市場。

2.2.2 實驗平臺搭建

基于DBDIMS的液體樣品實驗平臺搭建如圖1所示，具體如下：毛細管虹吸方式進樣，將DBDI水平放置向LTQ質譜噴射，毛細管樣品端距LTQ質譜進樣口0.5 cm，DBDI和MS進樣口的距離為2.0 cm，等離子束對準LTQ質譜進樣口中心偏下約2～3 mm處。氦氣氣瓶出氣口處接減壓閥，氣瓶通過外徑φ4氣管與DBDI機箱進氣口連接。DBDI單極放電工作的原理見文獻[8]。

中草藥實驗平臺搭建參照圖1，具體如下： DBDI100 45°反射式進樣，將生草烏、制草烏切片放于DBDI的輔助配件固體樣品夾上，上表面緊貼500質譜進樣口下方，DBDI距500 質譜儀進樣口2.0 cm，氦氣氣瓶出氣口處接減壓閥，氣瓶通過外徑φ4氣管與DBDI機箱進氣口連接。

LTQ質譜條件設置：毛細管溫度為275℃； 離子透鏡補償電壓為35 V； 毛細管電壓為7 V，LTQ質譜檢測m/z 50～800。

2.2.3 合成藥物檢測 將濃度為50 mg/L的MCT3IM2、MCT2PBD、MCTIME、MCTIMA的甲醇溶液，通過毛細管虹吸進樣，氦氣流速為3.0 L/min，DBDI控制氦氣溫度分別為100℃、200℃和150℃，譜圖采集時間為0.5 min。endprint

2.2.4 中草藥檢測 將濃度為20 mg/L的烏頭堿、中烏頭堿標準溶液，通過毛細管虹吸進樣，氦氣流速為4.0 L/min，DBDI的加熱溫度為200℃，譜圖采集時間為0.5 min。

將生草烏、制草烏切片，用鑷子夾住，放置在固體進樣平臺上，氦氣流速為4.0 L/min，DBDI的加熱溫度為200℃，譜圖采集時間為1 min。

3 結果與討論

3.1 合成藥物的DBDIMS研究

用DBDIMS對4種合成藥物進行檢測分析，在DBDI控溫100℃時，MCT3IM2離子化結果主要生成[M+H]+（m/z 287）離子，其噪聲較明顯。在DBDI控溫200 ℃時， MCT2PBD離子化結果主要生成[M+H]+（m/z 270）離子，其響應信號和信噪比的效果好； MCTIME主要生成[M+H]+（m/z 547）離子，在結構S氨基砜結構位置發生了斷裂，生成[M+H-124]+（m/z 423）碎片離子。MCTIMA除生成[M+H]+（m/z 465）離子外，由于沒有S氨基砜結構保護，不同位置的CO鍵在高能下容易發生斷裂，出現了2種斷裂形式（圖2D），在1位點斷裂生成特征碎片離子[M+H-173]+ （m/z 292），在2位點斷裂生成特征碎片離子[M+H-264]+（m/z 201）。實驗結果表明， DBDI對4種低極性合成藥物具有較好的電離效果（見圖2）。

3.2 草烏生物堿的DBDIMS研究

草烏的主要標志性有效成分為雙酯類生物堿，包括烏頭堿、中烏頭堿與次烏頭堿（Hypaconitine， HA）等。

烏頭堿、中烏頭堿、脫氧烏頭堿標準品的質譜結果如圖3所示。在正離子模式下檢測到烏頭堿標準品[M+H]+（m/z 646）離子，還檢測到[M+H-60]+（m/z 586）碎片離子（圖3A1）。隨著離子化時間的延長， [M+H]+（m/z 646）離子的相對豐度逐漸降低，[M+H-60]+（m/z 586）碎片離子的相對豐度逐漸增加，最后只檢測到[M+H-60]+（m/z 586）離子（圖3A2）； 中烏頭堿標準品主要生成[M+H]+（m/z 632）離子，同時還生成[M+H-60]+（m/z 572）碎片離子（圖3B1）； [M+H]+（m/z 632）離子的相對豐度逐漸降低，[M+H-60]+（m/z 572）碎片離子的相對豐度逐漸增加，最后只檢測到[M+H-60]+（m/z 572）離子（圖3B2）； 脫氧烏頭堿標準品除生成的[M+H]+（m/z 630）離子外，還生成[M+H-60]+（m/z 570）碎片離子（圖3C1）； 與烏頭堿、中烏頭堿相似，脫氧烏頭堿[M+H]+（m/z 630）離子的相對豐度逐漸降低，[M+H-60]+（m/z 570）的相對豐度逐漸升高，最后只檢測到[M+H-60]+（m/z 570）碎片離子（圖3C2）。

由實驗結果可知，在DBDI離子化作用下，烏頭堿、中烏頭堿、脫氧烏頭堿除生成[M+H]+離子外，都失去一分子的乙酸， 生成[M+H-60]+碎片離子，此結果也符合文獻[18]對烏頭類生物堿第一活性基團是C8位乙酰氧基的描述。隨著離子化時間延長，[M+H]+離子的相對豐度逐漸降低，[M+H-60]+離子的相對豐度逐漸升高。在軟電離條件下會發生特征斷裂，生成單酯生物堿[M+H-60]+特征碎片[19，20]，與本研究結果一致。

3.3 草烏與制草烏的DBDIMS研究

草烏中含有雙酯類和單酯類生物堿，而炮制過的烏頭塊根中含有單酯類生物堿[16，17]。 雙酯類生物堿在炮制過程中會發生酯鍵水解反應，先失去骨架上的C8位乙酰基生成單酯類生物堿，再繼續水解失去苯甲酰基生成烏頭原堿[21]。本實驗用DBDIMS方法比較草烏與制草烏中標志性烏頭類生物堿的譜圖差異（圖4）。根據荷質比可分為m/z 500～600與m/z 610～650 兩個區域，分別對應單酯類生物堿和雙酯類生物堿。在草烏中檢測到相對豐度較低的次烏頭堿[M+H]+（m/z 616）離子、中烏頭堿[M+H]+（m/z 632）離子與烏頭堿[M+H]+（m/z 646）離子。還檢測到烏頭堿[M+H-60]+（m/z 586）碎片離子、中烏頭堿[M+H-60]+（m/z 572）碎片離子、脫氧烏頭堿[M+H-60]+（m/z 570）碎片離子以及次烏頭堿[M+H-60]+（m/z 556）碎片離子，其中烏頭堿[M+H-60]+碎片離子的相對豐度最高（圖4A）。在制草烏中只檢測到相對豐度較高的次烏頭堿[M+H-60]+（m/z 556）碎片離子、中烏頭堿[M+H-60]+（m/z 572）碎片離子、烏頭堿[M+H-60]+（m/z 586）碎片離子，未檢測到次烏頭堿、中烏頭堿和烏頭堿的[M+H]+離子及脫氧烏頭堿的[M+H-60]+碎片離子（圖4B）。

本研究將DBDIMS聯用，檢測從當地中藥市場購買的草烏、制草烏，實驗結果表明， 草烏中的化學成分主要為雙酯類生物堿和單酯類生物堿，制草烏中的化學成分主要為單酯類生物堿。依據文獻[21]對草烏炮制程度的描述，表明本次檢測中購買的制草烏炮制程度處于第一階段。雙酯類生物堿失去骨架上的C8位乙酰基生成單酯類生物堿。 本方法可以在無需樣品前處理的條件下對草烏、制草烏的標志性化合物進行快速鑒定，能夠快速、靈敏地區分其炮制程度的不同，對草烏、制草烏的品質鑒別及正確使用具有重要的意義。

4 結 論

本研究將新型DBDI與MS聯用，對4種低極性的合成藥物進行分析，實驗結果表明， 4種合成藥物主要生成[M+H]+分子離子峰，同時MCTIMA發生結構斷裂，產生特有的碎片離子，有利于該物質的鑒定與結構分析，表明新型DBDI對4種藥物具有較好的電離效果。同時， 對草烏、制草烏切片進行快速分析，實驗結果表明， DBDIMS方法在無樣品前處理的條件下成功檢測到草烏、制草烏的烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿等標志性藥效成分，其中草烏中含有雙酯類和單酯類生物堿，制草烏中主要為單酯類生物堿，表明DBDIMS方法能夠快速、靈敏地鑒定草烏和制草烏的真偽、質量和炮制程度。本研究結果表明， 新型DBDI技術為藥物研究提供了一種新的、快速檢測方法，具有十分重要的理論和實際應用意義，在藥物研究領域具有極大的應用潛力。endprint