介孔沸石材料負載傳統基質用于激光解吸電離飛行時間質譜分析小分子化合物

楊夢瑞+李鵬+王敏+周劍+劉芳+張麗媛

摘 要 考察了介孔沸石材料負載傳統有機基質α氰基4羥基桂皮酸（CHCA）用于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDITOFMS）分析多肽Substance P和氟喹諾酮類藥物等小分子的效果。在相同的MALDITOFMS質譜條件下，與傳統CHCA進行了比較，同時分別考察了不同硅鋁比（SiO2/Al2O3）的ZSM5以及不同介孔大小的Beta與ZSM5沸石載體對Substance P的檢測效果。結果表明，沸石負載CHCA新型復合基質具有抑制堿金屬離子峰、消除干擾碎片離子、簡化與改善質譜圖、提高離子化效率等優點。 實驗結果表明，沸石表面酸性越強，有力介孔能夠充分包裹CHCA分子，則復合基質抑制干擾碎片和提高離子化效率的能力越高。復合基質成功應用于復雜樣品中恩諾沙星與諾氟沙星藥物小分子的MALDITOFMS檢測。

1 引 言

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDITOFMS）具有高靈敏、高通量、不影響分子結構完整性等諸多優點[1]，在分析小分子物質的研究中應用廣泛[2，3]。然而，由于傳統的有機基質，如2，4，6三羥基苯乙酮（THAP）、α氰基4羥基桂皮酸（CHCA）等，分子量都約為200 Da，在激光的輻照下，將在小質量數的范圍（< 500 Da）內產生大量的基質碎片，從而干擾小分子物質的檢測[4]。為克服這一缺點，一些新型的無機材料[3， 5]、石墨烯[6]、金屬有機化合物[7]、介孔材料[8]、納米顆粒[9]等，被用于修飾或取代傳統的有機基質，以達到抑制碎片、簡化譜圖等效果，實現了對小分子物質的檢測。例如傳統有機基質2，5二羥基苯甲酸（DHBA）在修飾的介孔硅材料輔助下，不但實現了基質碎片的充分抑制，而且能夠有效提高待測氨基酸、代謝物等小分子化合物的MALDITOFMS質譜峰信號強度。

沸石是一種具有介孔結構的鋁酸鹽材料，作為催化劑和吸附劑廣泛用于工業催化等領域[10]。在沸石的晶體結構中，由于Si4+被Al3+同晶置換，具有電負性的SiOAl橋鍵會被H+、NH+4、K+、Na+等離子平衡，如圖1所示，

而且這些離子可以相互交換在沸石表面[11， 12]。沸石的種類非常多，結構也不同，常見的有Y型沸石、絲光沸石、Beta沸石、ZSM5沸石等。沸石結構中硅鋁比（SiO2/Al2O3）的不同，其沸石的酸性、孔徑大小、穩定性以及親水性等都會隨之變化，從而影響沸石催化活性等[13]。近年來，沸石材料在MALDI基質研究與應用方面，取得了一些新的進展。Komori等[14]將傳統有機基質THAP嵌入質子化絲光沸石（HM20）介孔中，能夠有效抑制THAP的質譜碎片，消除堿金屬干擾的影響，提高目標分析物的信號強度。此外，銀納米顆粒負載介孔沸石作為無機MALDI基質，具有保護納米顆粒在激光輻照下的完整性、消除納米顆粒團聚效應、提高離子化效率、選擇性離子化等優點[15]。

本研究重點考察介孔沸石材料負載傳統基質CHCA用于MALDITOFMS分析小分子物質的效果。比較了不同硅鋁比、不同介孔大小的沸石材料，分析與探討沸石表面酸性大小及介孔結構對于檢測的影響，并利用沸石修飾基質成功實現復雜基質中藥物小分子的MALDITOFMS檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Shimadzu Biotech Axima Performance MALDITOFMS質譜儀（日本島津公司）， 配置N2激光源，激光波長337 nm，激光能量參數設定為30。

α氰基羥基肉桂酸（CHCA）、恩諾沙星D5同位素標記物、環丙沙星D8同位素標記物（美國Sigma公司）；恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星鹽酸鹽、培氟沙星、諾氟沙星等標準物質及雞蛋樣品，均來自農業部農產品質量標準研究中心；介孔沸石材料，包括Beta沸石及不同硅鋁比（SiO2/Al2O3）的ZSM5沸石等， 購自先豐納米材料科技有限公司（南京）；乙腈、甲醇等試劑均購于Merck公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 溶液配制 按照4∶2的質量比，分別稱取傳統基質CHCA和沸石（ZEO）顆粒，置于研缽中反復研磨混合15 min后，轉移至樣品瓶中，加乙腈水（1∶1，V/V）混合溶劑1 mL， 配制成濃度 4 mg/mL CHCA2 mg/mL ZEO的懸濁液。采用以上方法，分別配制CHCA與不同沸石材料的混合基質溶液：CHCA+Beta（40）、CHCA+ZSM5（38）、CHCA+ZSM5（170）、CHCA+ZSM5（500）（括號中的數字表示SiO2/Al2O3的比值）。采用相同的溶劑，配制4 mg/mL的CHCA基質溶液用于比較。

模型肽Substance P溶于乙腈水（1∶1，V/V），濃度為0.5 mg/mL；待測物恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星鹽酸鹽、培氟沙星、諾氟沙星等氟喹諾酮類藥物小分子混合標準液用0.2%甲酸甲醇溶液配制，濃度分別為0.01 mg/mL。

2.2.2 樣品前處理 在雞蛋樣品中加入適量恩諾沙星D5、環丙沙星D8同位素標記物，旋混、靜置，待平衡后加入1%甲酸乙腈溶液（V/V）4 mL沉淀蛋白，渦旋2 min后，4℃下8000 r/min離心10 min，重復上述步驟，合并兩次上清液。上清液中加入10 mL正己烷除脂，取下清液40℃氮吹干，復溶后過0.22 μm濾膜，待測。

2.2.3 質譜分析 分別取1.0 μL配制好的基質與待測樣品于樣品靶上混合，重復以上步驟后，待溶劑揮發完全，形成結晶后，利用MALDITOFMS儀器分析。待儀器狀態穩定后， 連續采集100張質譜圖的累加譜圖作為最終結果，數據采用Igor Pro軟件處理并分析。

3 結果與討論

3.1 CHCA負載沸石用于MALDITOFMS分析的考察endprint

選擇模型肽Substance P（Sub P）為待測物，與傳統有機基質CHCA直接混合于樣品靶上，在正離子模式下進行MALDITOFMS分析，結果見圖2A。可檢測到待測物質譜峰[Sub P+H]+（m/z 1347）、[Sub P+Na]+（m/z 1369）， 同時也能明顯觀察到基質CHCA相關的質譜峰 [CHCA+H]+（m/z 190）、[CHCA+Na]+（m/z 212）和[2CHCA+H]+ （m/z 379），但是在200～400 Da質量范圍內，有很多碎片離子。為抑制基質碎片，通過物理混合的方式，將CHCA負載于選擇質子交換、SiO2/Al2O3比值為38的ZSM5沸石上。在相同的質譜條件下，利用此復合基質分析Sub P，如圖2B所示。通過比較發現，采用ZSM5沸石復合基質，不但能有效抑制堿金屬相關的質譜峰 [CHCA+Na]+、[SubP+Na]+以及離子碎片，簡化譜圖，而且可以極大提高Sub P的質子化峰[Sub P+H]+的強度。因此，ZSM5沸石的介孔結構對于CHCA的包裹作用，可有效保護CHCA分子的完整性，同時介孔結構的均勻分布又能夠使CHCA很好地分散，提高MALDITOFMS測量的重復性。另一方面表明，沸石表面的質子發生了轉移，并參與了Sub P離子化的過程，進而提高了其質子化峰強度。這與Yamamoto等揭示的沸石能夠有效傳遞激光能量以及沸石表面質子有助于提高目標分析物質子化峰強度的作用機理一致[16]。

3.2 沸石表面酸性大小的影響

由于沸石表面酸性大小與其結構中SiO2/Al2O3比成反比，因此，為了進一步驗證沸石表面質子對抑制碎片、提高樣品離子化效率等的作用機理，選擇相同結構類型、但硅鋁比不同的ZSM5沸石進行比較。分別按照相同的比例與方法，將CHCA基質負載于SiO2/Al2O3比值分別為170和500的ZSM5（170）和ZSM5（500）沸石材料上，在相同的條件下對Sub P進行MALDITOFMS分析。從圖3可見，與圖2B比較，當表面質子減少后，基質與樣品的碎片又明顯增加，對堿金屬相關碎片的抑制能力減弱，而且[SubP+H]+的峰強度也有降低。由此可見，沸石表面布朗氏酸位多少或酸性大小，對于抑制碎片、提高待測物峰強度有直接關系。在3種不同硅鋁比的沸石中，ZSM5（38）沸石負載CHCA 的效果更好。

3.3 沸石結構的影響

沸石作為介孔材料，由于其基本單元不同，介孔的大小也不完全相同，因此，介孔對于CHCA分子的包裹能力也可能不同。為了考察介孔結構對于MALDITOFMS分析結果的影響，選擇SiO2/Al2O3比值接近ZSM5（38）的Beta（40）沸石。結果如圖4所示，采用Beta（40）沸石作為載體，對碎片的抑制作用更有效。通過與圖2B比較發現，質譜峰[CHCA+H]+，[2CHCA+H]+明顯降低，因此推測Beta（40）沸石介孔對CHCA的包裹能力更強。根據范德瓦爾斯分子體積公式[17]計算可知，CHCA分子的理論直徑為0.68 nm，而所使用的的沸石材料ZSM5（38）與Beta（40）的表征結果顯示，其介孔大小分別為0.53～0.55 nm和0.55～0.70 nm，結果與我們推測的一致。Beta（40）具有較大的介孔孔徑，大于CHCA分子理論直徑，對負載的CHCA包裹與保護能力更強，因此，對基質碎片的抑制作用也明顯。

3.4 沸石基質用于藥物小分子的MALDITOFMS分析

本研究選擇了6種常見氟喹諾酮類藥物小分子作為被分析物，包括恩諾沙星（ENR）、環丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFX）、洛美沙星（LOM）、培氟沙星（PEF）和諾氟沙星（NOR），考察了Beta（40）沸石負載的CHCA在藥物小分子分析中的效果，同時與不負載的CHCA進行比較，如圖5所示。圖5A中， 6種氟喹諾酮類藥物質譜峰分別為[ENR+H]+（m/z 360.67），[CIP+H]+（m/z 332.57），[OFX+H]+（m/z 362.66），[LOM+H]+（m/z 352.63），[NOR+H]+（m/z 320.54），[PEF+H]+（m/z 334.59），而且在質量數300～400 Da 范圍內有大量的碎片。為了實現抑制干擾碎片的目的，實驗選擇了Beta（40）沸石負載的CHCA復合基質，在相同的實驗條件下分析藥物小分子，如圖5B所示，6種氟喹諾酮類藥物的質子峰明顯，而且干擾的離子碎片被充分抑制，譜圖簡化。

為了考察沸石復合基質在實際復雜樣品分析中應用的可行性，選擇含有恩諾沙星和環丙沙星的陽性雞蛋樣品，在樣品前處理前添加適量D8環丙沙星（D8CIP）和D5恩諾沙星（D5ENR）同位素標記物，待平衡后完成樣品前處理后檢測。如圖6所示，恩諾沙星、環丙沙星及其同位素標記物的質譜峰[ENR+H]+（m/z 360.67）、[CIP+H]+（m/z 332.57）、[D5ENR+H]+（m/z 365.67）和[D8CIP+H]+（m/z 340.57）被成功檢出，這為利用同位素內標實現MALDITOFMS定量分析提供了參考。

4 結 論

本研究結果表明，介孔沸石材料負載傳統有機基質作為一種新型的復合MALDI基質，具有抑制干擾碎片、簡化質譜圖、提高質子化效率等優點，可應用于恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星和諾氟沙星等氟喹諾酮類小分子以及復雜基質樣品中此類小分子物質的MALDITOFMS分析。endprint