納升液相色譜質譜分析方法的重現(xiàn)性對尿液多肽組分析結果的影響

王勇+吳利+徐金玲+李水明 劉寧 姜亮

摘 要 多肽組學是蛋白質組學技術的延伸和擴展，在醫(yī)學和生物學研究中的應用日益廣泛，但是，多肽組鑒定方法的重現(xiàn)性對實驗結果的影響目前尚不清楚。本研究利用納升液相色譜高分辨質譜對健康人的尿液多肽組進行了7次平行分析，考察圖譜數(shù)目、圖譜利用率、鑒定的肽段數(shù)目、蛋白質數(shù)目、樣品總離子強度和肽段保留時間等指標的變化，以揭示重復實驗之間分析結果的可變性和穩(wěn)定性。7次測定的肽段數(shù)目平均值為208，標準偏差為38； 7次結果合并后，得到了歸屬于114個蛋白質的426個肽段，肽段和蛋白質數(shù)目均顯著增加； 而35個蛋白質的109個肽段在所有7次實驗中均被檢出，表明多肽組的單次分析結果既具有一定的隨機性，又具有相對的穩(wěn)定性。增加平行實驗次數(shù)會擴大多肽組數(shù)據(jù)集，但測定3次以上后增加幅度減小。相比于肽段，多肽組的結果在蛋白質水平上更為穩(wěn)定，提示利用蛋白質為多肽組的生物標志物更為穩(wěn)健。

1 引 言

多肽組學的概念提出于20世紀初期，多肽組是指體液、組織和細胞等生物體內全部內源性多肽，蛋白質的異常降解產(chǎn)物與多種生理病理過程相關，因此多肽組是生物標記物的重要來源[1～3]，血液，尿液，唾液、腦脊液、汗液、眼淚和胸腔積液等體液的多肽組均已有報道[4～12]。此外，還出現(xiàn)了神經(jīng)活性多肽[13，14]、細胞[15，16]、組織[17，18]、植物汁液[19]和各種標記或非標記的定量多肽組學研究[20～22]。

多肽組學是蛋白質組學延伸和擴展，將肽段分離后不經(jīng)過特異性酶切直接進行質譜分析。早期的多肽組研究通常采用基質輔助激光解吸離子化飛行時間質譜（MALDITOF）方法[23]，該方法只能給出分子量信息并且由于電離抑制效應導致檢出的肽段數(shù)目較少，與液相色譜（LC）MALDI聯(lián)用和使用串聯(lián)飛行時間質譜（TOF/TOF）可獲得更多的肽段數(shù)目和序列信息[24，25]，但改善并不顯著。近年來高分辨質譜技術愈發(fā)成熟，掃描速度也不斷增加，與液相色譜聯(lián)用顯著地提高了分離分析能力，因此，納升液相色譜電噴霧串聯(lián)質譜成為多肽組分析的重要方法，不僅可以準確鑒定肽段序列，還能發(fā)現(xiàn)階梯序列肽段以及氧化和磷酸化修飾的肽段。此外，各種蛋白質組學中的定量標記方法也開始應用于多肽組學分析。在蛋白質組學研究中， 考察質譜分析的重現(xiàn)性時發(fā)現(xiàn)， 肽段水平的可變性高于蛋白質，高分辨質譜的重現(xiàn)性優(yōu)于低分辨質譜； 此外，分析結果的重現(xiàn)性還與樣本復雜程度相關，技術性重復的最高重現(xiàn)性也只有80%，而最低僅為35%[26]，但分析方法的重現(xiàn)性對多肽組分析結果的影響尚未見文獻報道。本研究通過將同一樣品連續(xù)分析7次，考察數(shù)據(jù)依賴的掃描方式下方法的重現(xiàn)性對實驗結果的影響，實驗發(fā)現(xiàn)，分析方法的重現(xiàn)性對多肽組的鑒定結果，尤其是對低豐度肽段和蛋白仍有一定影響。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

EksigentnanoLCUltraTM 2D 系統(tǒng)、TripleTOF 5600 plus高分辨質譜儀、Protein Pilot 4.5軟件（美國AB SCIE公司）； 真空冷凍干燥機（美國Thermo Savant公司）； C18反相色譜捕集柱（100 μm × 3 cm，3 μm，15 nm， 美國Eksigent公司）； C18反相色譜分析柱（75 μm × 15 cm， 3 μm， 12 nm，美國Eksigent公司）。納升液相色譜流動相 A為0.1% 甲酸2% 乙腈，流動相 B為0.1% 甲酸98% 乙腈； 所用試劑為質譜純或優(yōu)級純，均購自美國Thermo Fisher公司； 氧化石墨烯磷酸鑭納米磁性復合材料為自行合成[1]。

2.2 反相色譜Triple TOF質譜分析

多肽的分離和富集如文獻[1]所述， 以上步驟7份樣品同時操作， 收集上清合并后冷凍干燥。將分離凍干的多肽樣品溶解于NanoRPLC流動相 A中， NanoRPLC液相色譜為EksigentnanoLCUltraTM 2D系統(tǒng)（美國AB SCIEX）， 溶解后的樣品以2 μL/min的流速上樣到C18預柱上（100 μm×3 cm， 3 μm， 15 nm）， 然后保持流速沖洗脫鹽10 min。分析柱是C18反相色譜柱（75 μm×15 cm， 3 μm， 12 nm）， 梯度洗脫條件： 0～42 min， 5%～25% B； 42～56 min， 25%～40% B； 56～64 min， 80% B； 64～70 min， 5% B。質譜采用TripleTOF 5600+ 系統(tǒng)（美國AB SCIEX公司）。， 納升噴霧III離子源， 噴霧電壓為2.4 kV， 氣簾氣壓為207 kPa， 霧化氣壓為34.5 kPa， 加熱溫度為150℃， 質譜掃描方式為數(shù)據(jù)依賴的采集工作模式（Information dependent analysis， IDA）。一個質譜循環(huán)3 s， 1張全譜加30張串聯(lián)質譜， 選取前top20并且CPS>300的前體離子進行串聯(lián)質譜分析， 每張串聯(lián)譜的采集時間為80 ms。

2.3 數(shù)據(jù)分析

質譜采集到的原始wiff圖譜文件， 采用Protein Pilot Software v. 4.5（AB SCIEX， USA）軟件進行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析， 數(shù)據(jù)庫為uniprot庫中的Homo sapiens人種專一數(shù)據(jù)庫（包含20210條蛋白質序列， 2015年1月2日下載）， 檢索參數(shù)設置為非酶切、磷酸化強調和生物學修飾， 假陽性率控制為1% FDR。

3 結果與討論

3.1 多肽組鑒定結果的重現(xiàn)性分析

如圖1所示， 7次分析的總離子流圖相近， 說明分析結果具有重現(xiàn)性， 但是， 經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索后， 發(fā)現(xiàn)圖譜總數(shù)、圖譜利用率、特異性肽段數(shù)目、所有肽段所歸屬的蛋白質數(shù)目和總離子強度等指標有較大變化（表1）。其中， 不同次測量中數(shù)值幅度變化最小的為圖譜數(shù)目， 最高值為最低值的1.29倍；endprint

而變化幅度最大的為總離子流強度， 最高值為最低值的3.96倍； 特異性肽段數(shù)目的變化倍數(shù)為1.72倍， 但蛋白質檢出差異相對較小， 為1.43倍； 肽段數(shù)目、蛋白質數(shù)目和總離子強度的相對標準偏差（RSD）分別為18%、11%和52%。以上結果說明， 多肽組的單次分析結果具有一定的隨機性。此外， 雖然總體上圖譜數(shù)目與檢出的肽段、蛋白質數(shù)目和總離子強度具有正相關性， 但并不具有嚴格的對應關系。值得注意的是， 將7次結果合并后， 得到了歸屬于114個蛋白質的426個肽段， 肽段和蛋白質數(shù)目均比單次測定的最高值增加50%以上， 該尿液樣品所鑒定得肽段數(shù)目少于本研究組前期報道的790條肽段的結果[1]， 可能是由于樣品差異所致， 但兩次實驗都檢測到了血紅蛋白和尿調節(jié)素等蛋白質[1]， 同時觀察到了高豐度蛋白質的階梯序列特征。 Hart等人[27]利用碰撞誘導解離（CID）方式鑒定到了歸屬于40個蛋白質的74個肽段， 肽段數(shù)目不到蛋白質數(shù)目的2倍， 應該無明顯的階梯序列存在。進一步比較7次分析中的共有肽段和蛋白發(fā)現(xiàn)， 歸屬于35個蛋白質的109個肽段在所有7次測量中均被檢出， 但其中60個肽段歸屬于血紅蛋白α亞基和β亞基， 尿調節(jié)素、凝聚素和血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑5種蛋白質， 這也進一步驗證了之前所提出的多肽組中肽段分布具有不均一性的結論[1]。

3.2 共有肽段實驗重復性的分析

液相色譜保留時間和信號強度是衡量結果重現(xiàn)性的兩個重要指標， 為說明重復實驗中這兩種指標的變化幅度， 在109條共有肽段中隨機選取了歸屬于血紅蛋白α鏈和尿調節(jié)素的各5條肽段考察保留時間的變化幅度（表2）， 發(fā)現(xiàn)雖然肽段SGSVIDQSRVLNLGPITRK出峰時間最多相差了1 min以上， 但大多數(shù)肽段的保留時間較為恒定， 在不同分析輪次中的變化幅度小于0.5 min， 最小相差0.004 min， 10條肽段的相對標準偏差（RSD）為0.031%～1.500%， 以上結果達到了目前納升液相色譜儀器的性能指標， 提示不同次分析中肽段和蛋白質數(shù)目的差別不是由于實驗錯誤導致。從表2還可知， 肽段序列僅變化1個氨基酸就可能對液相色譜的保留時間造成較大改變。

在多肽組學的生物標記物研究中， 通常利用同一肽段在不同樣本的離子強度作為非標記定量的指標， 本研究比較上述10條肽段在7次平行實驗中的變化（表3）， 發(fā)現(xiàn)變化幅度很大， RSD為6.7%～59.4%， 平均值為32.9%， 只有3條肽段的RSD<15%， 有3條肽段的最低離子強度和最高離子強相差約10倍， 但多數(shù)肽段的強度接近平均值。以上現(xiàn)象的原因可能是由于采用目前分析常用的數(shù)據(jù)依賴性的采集模式， 每個色譜峰的采集點數(shù)有限， 液相色譜保留時間的微小變化就可能對信號強度造成較大影響， 但也不排除電噴霧過程具有一定的隨機性。以上結果提示， 在利用同一肽段在不同樣本中的離子強度作為生物標志物篩選依據(jù)時， 需要考慮方法重現(xiàn)性的影響。

3.3 測量次數(shù)對肽段和蛋白質鑒定數(shù)目的影響

在MALDITOF質譜分析的過程中， 激光激發(fā)次數(shù)一般在上千次以上， 得到的圖譜實際上是多張圖譜的疊加， 因此， MALDITOF質譜具有較好的重現(xiàn)性， 但對于多肽組和蛋白質組這樣的復雜體系， 得到的信息量不夠。液相色譜串聯(lián)質譜可以給出更豐富的信息， 但如上所述， 一次分析的結果不能代表尿液多肽組的全部情況， 由于在實際分析過程中受樣本量和分析成本等的限制， 較難進行過多的重復性實驗， 并且實驗次數(shù)過多也會造成邊際效應遞減， 因此， 本研究考察了重復次數(shù)對分析結果的影響。

如將7次分析合并后的歸屬于114個蛋白質的426個肽段近似視為尿液多肽組的“全集”。將任意兩次分析結果排列組合后產(chǎn)生了21種組合， 結果表明， 兩種組合的肽段及其歸屬蛋白的數(shù)目都與全集相差較大（圖2）。比較3～6種組合情況下所得到的肽段和蛋白質數(shù)目（圖3）， 發(fā)現(xiàn)3次分析次數(shù)以上肽段和其歸屬蛋白質的數(shù)目增加幅度開始變緩， 而5次分析的結果已經(jīng)與7次分析基本接近。基于此， 可以認為對同一樣品進行至少3次分析的合并結果會更全面地反映其多肽組的組成。由于個體差異， 在利用多肽組方法研究實際問題時， 多未提及重復次數(shù)[11～16]， 說明該問題尚未引起足夠重視。

3.4 共有肽段和差異肽段在蛋白質水平上的分析

由于液相色譜質譜分析方法的偶然性， 隨著測量次數(shù)增加， 所鑒定到的交集數(shù)目越來越小。例如， 1和2的共有特異性肽段數(shù)目為189條， 前5次測量的共有肽段數(shù)目則為132條， 而7次合并后該數(shù)目則為109條， 隨著合并次數(shù)的增加， 共有肽段數(shù)目的減小幅度也減小， 因此， 可以認為在7次分析中均檢測到的肽段具有較高的檢出概率， 即雖然數(shù)據(jù)依賴的掃描和采集方式的分析結果具有一定偶然性， 但仍具有較強的穩(wěn)定性。例如， 雖然每次分析所鑒定的蛋白質數(shù)目不同， 但排名在前20位的蛋白質具有90%以上的檢出率， 血紅蛋白α鏈和尿調節(jié)素的Unused值排名總是在第一和第二位， 血紅蛋白α鏈在7次檢測中鑒定到的數(shù)目分別為24、27、30、31、33、34和36次， 其它蛋白質也存在類似規(guī)律， 即如果某蛋白質被鑒定的肽段數(shù)目較多， 則它總體上就有更高的檢出概率并且可靠性排名（Unused值）相對穩(wěn)定。換言之， 如果在兩個不同結果中排名靠前的蛋白質發(fā)生明顯變化， 則一定是樣本本身的原因而非來自方法的偶然誤差。但反之未必成立， 有些排名靠后的蛋白質也具有穩(wěn)定性， 例如， 歸屬于40S核糖體蛋白S12的只有一個肽段AEEGIAAGGVMDVNTALQEVLK， 但它在所有7次測定中均被檢出。值得注意的是， 肽段的檢出率受離子強度的影響并不大， 這可能是因為質譜儀具有4個數(shù)量級以上的線性范圍。例如， 在第一次分析中， 共檢測到277個肽段， 離子強度的最小值為198， 最大值為204816， 平均值為4650， 而在第一次分析結果的共同109個肽段中， 最低值為363， 最高值為50366， 平均值為3582。值得注意的是， β防御素1的肽段GNFLTGLGHRSDHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCC在所有277個肽段中的離子強度最高， 為204816， 但其在第2、3、4和7輪分析中均未測到， 在第5和第6次分析中的強度分別為197775和182780， 具體原因尚需進一步分析。endprint

另一方面， 如果在實際工作中只做一次實驗， 希望能對可能漏檢的肽段做出趨勢性預測， 因此， 將單次分析結果與7次分析合并的結果進行了比較。首先， 重復實驗可能發(fā)現(xiàn)肽段序列中氨基酸殘基取代信息， 例如， 在第1次實驗中共檢測到5個含有YQKVVAGVANALAHKYH序列的肽段， 但在7次合并結果中測到了7個， 多出的兩個分別為該肽段的12位亮氨酸被谷氨酸取代和11位的甘氨酸被絲氨酸取代。其次， 有些合并后增加的肽段來自單次分析已鑒定出的蛋白質， 即鑒定出的肽段數(shù)目增加， 但歸屬蛋白的數(shù)目未增加， 例如， 與第1次分析相比， 7次合并后血紅蛋白α鏈多鑒定出6條肽段， 尿調節(jié)素多鑒定出7條肽段， 這些新增肽段與已鑒定肽段存在關聯(lián)性， 例如， 在第一次分析中鑒定含有DQSRVLNLGPITR序列的總共15條肽段（如VIDQSRVLNLGPITRK）， 但未鑒定到該肽段， 鑒定到肽段VIDQSRVLNLGPITRKGV， 但未鑒定到VIDQSRVLNLGPITRKG， 血紅蛋白α鏈和膠原蛋白α1鏈等其它蛋白也存在類似情況， 因此， 可以謹慎推測， 在單次分析的情況下， 特別是對于階梯序列肽段， 還存在一些未被鑒定的相關肽段是可能的。通過增加測定次數(shù)鑒定到的肽段出現(xiàn)頻率很低， 通常僅在7次中的1或2次能被檢測到， 但歸屬于新的蛋白質， 因此， 以這類蛋白質作為潛在的生物標志物最好進行平行實驗的驗證以排除方法原因。

蛋白質組學和多肽組學的檢測對象都為肽段， 分析結果都受樣本處理方法和分析次數(shù)的影響， 對于高豐度的蛋白質或肽段這兩種分析體系的重現(xiàn)性都較好， 但后者為不經(jīng)過特異性酶切的天然降解肽段， 經(jīng)常檢出的階梯降解序列肽段對于蛋白質鑒定而言有冗余性。因此， 多肽組的分析結果在蛋白質水平上的重現(xiàn)性要優(yōu)于肽段。

4 結 論

本研究結果表明， 即使對于尿液這樣簡單的體系， 鳥槍法的重現(xiàn)性對多肽組定性結果的影響仍不可忽視。研究發(fā)現(xiàn)3次平行實驗后肽段及其歸屬蛋白質數(shù)目增加趨于平緩。進一步分析表明， 多肽組中低豐度肽段的鑒定具有一定的偶然性， 而高豐度肽段的鑒定具有較強的穩(wěn)定性； 在蛋白質水平上， 單次測定與7次合并分析對高豐度蛋白質的鑒定結果基本一致， 說明利用蛋白質作為多肽組學生物標志物的指標在方法學上更為穩(wěn)健， 提示若兩組不同樣品在蛋白質水平存在多條肽段的有和無的差異， 則單次分析亦可得到可靠的結果。但是， 如果僅利用單一肽段的差異表征生物標記物， 則需要進行3次以上的平行實驗。本研究結果可為多肽組學生物標記物研究提供方法學依據(jù)和參考。endprint