基于雙重猝滅原理的分子信標(biāo)定量檢測凝血酶

翟琨+李奉權(quán)+史伯安+向東山

摘 要 利用G堿基和有機猝滅基團對熒光基團的雙重猝滅作用構(gòu)建了分子信標(biāo)，建立了一種基于雙重猝滅原理的檢測凝血酶的簡單方法。此分子信標(biāo)中熒光基團設(shè)計為羧基熒光素（FAM），有機猝滅基團設(shè)計為Black Hole Quencher 1 （BHQ1），BHQ1連接3個含有G堿基的核苷酸，分子信標(biāo)的環(huán)設(shè)計為凝血酶的核酸適配體。體系中沒有凝血酶時，分子信標(biāo)呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團FAM與有機猝滅基團BHQ1及G堿基相互靠近，F(xiàn)AM的熒光在BHQ1及G堿基的雙重猝滅下，其熒光信號很弱； 當(dāng)體系中有凝血酶存在時，分子信標(biāo)與凝血酶特異性結(jié)合，形成G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，F(xiàn)AM遠離猝滅基團BHQ1及G堿基，其熒光得到恢復(fù)。在最適條件下，體系的熒光強度（ΔI）與凝血酶的濃度（C）在0.4～40 nmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔI=24.63C （nmol/L）+13.06 （R2=0.9972），檢出限為0.18 nmol/L （3σ， n=9）。實際血樣加標(biāo)回收率為96.3%～98.7%。

1 引 言

凝血酶（Thrombin，TB）是一種由凝血酶前體形成的絲氨酸蛋白酶，在人體凝血過程中發(fā)揮了重要作用[1，2]。適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)，經(jīng)體外篩選得到的能與蛋白質(zhì)或小分子的特定區(qū)域相結(jié)合的寡聚核苷酸片段（DNA或RNA），可以特異性地識別相應(yīng)的靶分子[3～8]。迄今，已篩選到的凝血酶核酸適配體序列有兩個，一個是由 15個堿基構(gòu)成的能識別凝血酶的肝素結(jié)合位點的適配體，另一個是由29個堿基構(gòu)成的能識別凝血酶血纖維蛋白結(jié)合位點的適配體[9，10]。目前，這兩種凝血酶核酸適配體都已被廣泛用于凝血酶的檢測[11～14]。

分子信標(biāo)是一種可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，具有選擇性好、檢測速度快以及無需與未反應(yīng)的探針分離即可實時檢測等特點，廣泛應(yīng)用于核酸檢測分析[15～17]。目前分子信標(biāo)在凝血酶的檢測中已有應(yīng)用，但使用的多為傳統(tǒng)的分子信標(biāo)，熒光背景較高，影響了定量分析的靈敏度[18，19]。

本研究基于鳥嘌呤（G堿基）對FAM具有較好的猝滅作用[20，21]的原理，利用G堿基和有機猝滅基團對FAM的雙重猝滅作用，設(shè)計了一種結(jié)構(gòu)簡單、合成容易的具有雙重猝滅作用的分子信標(biāo)，穩(wěn)定性好， 熒光背景信號低， 與凝血酶反應(yīng)速度快，基于此建立了快速定量檢測凝血酶的新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與及試劑

RF5301PC熒光光譜儀（日本Shimadzu公司）； 凝血酶（上海麥克林生化科技有限公司（中國））； 牛血清蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）、牛血紅蛋白（HB），購于上海邦景實業(yè)有限公司； 其它試劑均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司； 實驗所用緩沖溶液為0.1 mol/L TrisHCl 緩沖溶液； 所有的分子信標(biāo)均由上海生工生物技術(shù)有限公司（中國）合成，其序列如表1所示。

2.2 樣品制備及檢測

將分子信標(biāo)及凝血酶分別用0.1 mol/L TrisHCl （pH 8.0）緩沖溶液配制成400 nmol/L儲備液，并分別稀釋成不同濃度的溶液，備用。取50 μL凝血酶溶液加入到50 μL的分子信標(biāo)溶液中，混合均勻，補加TrisHCl緩沖溶液至500 μL，室溫下反應(yīng)30 min，檢測熒光信號。本研究采用同步熒光分析法，因為FAM的最大激發(fā)波長與最大發(fā)射波長之差（斯托克斯位移）為26 nm，因此實驗中同步掃描的波長間隔（Δλ）設(shè)置為26 nm，熒光分光光度計的激發(fā)及發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為10 nm。

2.3 選擇性實驗

在4份50 μL 400 nmol/L凝血酶溶液中，分別加入50 μL蒸餾水、50 μL 濃度為4×10

Symbolm@@ 4 mol/L的牛血清蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、牛血紅蛋白（HB）溶液，再分別加入50 μL 400 nmol/L分子信標(biāo)溶液，最后加入TrisHCl緩沖溶液至500 μL，混合均勻，常溫下反應(yīng)30 min后，進行熒光檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測原理

利用雙重猝滅分子信標(biāo)檢測凝血酶的原理如圖1所示。體系中沒有凝血酶存在時，分子信標(biāo)呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團FAM與猝滅基團BHQ1及G堿基相互靠近，F(xiàn)AM的熒光在BHQ1及G的雙重猝滅下，其熒光信號很弱； 體系中存在凝血酶時，分子信標(biāo)的環(huán)即凝血酶的適配子序列與凝血酶特異性結(jié)合形成G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，F(xiàn)AM熒光基團遠離猝滅基團BHQ1及G堿基，熒光得到恢復(fù)。凝血酶濃度越高，與其結(jié)合的分子信標(biāo)越多，即更多的環(huán)被打開，因此體系的熒光信號越強，通過FAM熒光信號增強的程度可實現(xiàn)對凝血酶的定量檢測。

3.2 雙重猝滅分子信標(biāo)的構(gòu)建

本研究中，凝血酶的檢測是基于有機猝滅基團和G堿基對熒光基團的雙重猝滅作用。選擇能被G堿基猝滅的有機染料FAM 作為分子信標(biāo)的熒光基團， BHQ1作為分子信標(biāo)的猝滅基團，因為BHQ1的最大吸收波長為535 nm，F(xiàn)AM的最大發(fā)射波長為525 nm，因此在BHQ1與FAM相互靠近時，F(xiàn)AM的熒光能被BHQ1很好地猝滅。另外，與BHQ1相連接的G堿基數(shù)目越多，猝滅的效果越好[22]。本研究設(shè)計了G堿基數(shù)目分別為3個、2個、1個及沒有G堿基的4種分子信標(biāo)（即MB1、MB2、MB3、MB4），并與沒有猝滅基團的分子信標(biāo)（MB6）的猝滅效果進行比較（圖2）。結(jié)果表明，隨著G堿基數(shù)目的增加，分子信標(biāo)的背景熒光逐漸降低，但降低的程度逐漸減小。這主要是因為增加的G堿基與熒光基團的距離逐漸增加的緣故。因此，選擇MB1對凝血酶進行檢測。

圖2 分子信標(biāo)莖的不同G堿基數(shù)目對猝滅效果的影響（a→e： MB1，MB2，MB3，MB4，MB6），各分子信標(biāo)的濃度均為32 nmol/Lendprint

Fig.2 Effect of the number of G base in the stem of MB on quenching effect （a→e： MB1， MB2， MB3， MB4， MB6）. Concentration of each MBs is 32 nmol/L， respectively

3.3 雙重猝滅分子信標(biāo)性能評價

對不同猝滅基團猝滅FAM的效果進行考察（圖3）。結(jié)果表明，當(dāng)分子信標(biāo)中既沒有G堿基也沒有猝滅基團（MB6）時，體系具有較強的熒光信號（圖3d）； 當(dāng)分子信標(biāo)中只有有機猝滅基團（MB4）或只有G堿基（MB5）時，分子信標(biāo)的熒光信號顯著減弱（圖3b， 3c），說明有機猝滅基團BHQ1和G堿基對FAM都具有很好的猝滅作用； 當(dāng)分子信標(biāo)中既有G堿基， 又有有機猝基團BHQ1（MB1）時，分子信標(biāo)的熒光信號變得非常微弱（圖3a），說明G堿基和有機猝基團BHQ1對FAM的雙重猝滅效果更好。根據(jù)計算，經(jīng)典分子信標(biāo)（MB4）的猝滅效率為90.3%，信背比（沒有猝滅基團的分子信標(biāo)所產(chǎn)生的信號與有猝滅基團的分子信標(biāo)所產(chǎn)生的信號之比）為10.3； 雙重猝滅分子信標(biāo)的猝滅效率為97.5%，信背比為39.8。因此，基于雙重猝滅的分子信標(biāo)的熒光背景遠低于經(jīng)典分子信標(biāo)。

3.4 工作曲線及檢出限

考察了凝血酶的濃度與相應(yīng)的體系熒光強度之間的關(guān)系，圖4為不同濃度的凝血酶所對應(yīng)的同步熒光光譜圖。在0.4～ 40.0 nmol/L范圍內(nèi)，體系的熒光強度（ΔI）與凝血酶的濃度（C）具有良好的線性關(guān)系（圖4插圖），線性回歸方程為ΔI= 24.63 C （nmo/L）+13.06 （R2=0.9972），檢出限為0.18 nmol/L（3σ， n=9）。對3.0 nmol/L凝血酶重復(fù)測定9次，響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 3.7%，說明此方法精密度良好。

3.5 選擇性

對建立的檢測方法的特異性進行了考察（圖5）。結(jié)果表明， 40 nmol/L凝血酶溶液中加入40.0 μmol/L的BSA、OVA及HB后，各體系的熒光強度幾乎無變化，說明這幾種干擾蛋白的存在對凝血酶的檢測沒有明顯影響，表明此分析方法具有良好的選擇性。

與文獻報道的利用適配體或熒光方法檢測凝血酶方法相比（表2），本方法檢出限更低。

3.6 血清樣品的加標(biāo)回收實驗

取人血清樣品，離心后稀釋500倍； 取2份稀釋后的血清樣品，分別加入不同濃度水平的凝血酶，利用本方法進行檢測（表3）。兩個加標(biāo)水平的回收率為96.3%和98.7%，說明本方法具有較高的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

利用G堿基和有機猝滅基團對熒光基團的雙猝滅作用構(gòu)建了一種結(jié)構(gòu)簡單的基于雙重猝滅原理的分子信標(biāo)，并建立了一種檢測凝血酶的簡單方法，獲得了更低的檢出限（0.18 nmol/L）。endprint