基于離心式富集裝置的酪氨酸磷酸肽分析新方法

孫婕+張萬軍+時照梅+秦偉捷 錢小紅

摘 要 酪氨酸磷酸化及其相應激酶活性的研究在抗腫瘤藥物靶點的研發中具有重要意義。由于酪氨酸磷酸化僅占蛋白質總磷酸化含量的不足0.1%，因此規模化的酪氨酸磷酸化鑒定面臨著重大技術挑戰。本研究構建了TiO2串聯C18反相填料的離心式富集裝置，結合抗體免疫沉淀法，建立了酪氨酸磷酸肽的富集策略。此新型富集裝置由吸頭、適配器和離心（EP）管組成，將TiO2富集磷酸肽和C18填料反相分離磷酸肽有機結合，以離心的方式進行樣品的上樣、清洗、洗脫和分離，再通過抗酪氨酸磷酸化抗體進一步特異性富集酪氨酸磷酸肽，從而實現了酪氨酸磷酸肽的高效富集和大規模質譜鑒定。通過離心式富集裝置簡化了實驗步驟，減少了樣品損失和人為因素干擾； 而且離心式、平行化的樣品處理方式可顯著提高分析通量。將此策略成功用于小鼠肝臟蛋白質酪氨酸磷酸化肽段的富集和質譜鑒定，在5 mg鼠肝蛋白中共鑒定出967個酪氨酸磷酸化位點，對應545個蛋白質，顯示了其在蛋白質組學研究中的應用潛力。

1 引 言

激酶調控的蛋白質磷酸化修飾是最常見、最重要的蛋白質翻譯后修飾之一，幾乎參與調節生命活動的所有過程，包括細胞的增殖、發育和分化、細胞凋亡、神經活動和新陳代謝等[1～3]。其中，蛋白質酪氨酸磷酸化及相應激酶（Protein tyrosine kinase，PTK）是細胞信號轉導過程中的關鍵因子，在細胞增殖、血管生成、細胞遷移、基因轉錄和代謝反應等調節機制中均發揮著重要作用[4]。PTK的活性異常會擾亂其下游的酪氨酸磷酸化修飾和相關信號通路，進而引起細胞信號調節紊亂，最終導致腫瘤形成[5]。已有研究表明，酪氨酸激酶的過度激活與腫瘤的發生、發展和預后均密切相關[6，7]。因此，以酪氨酸激酶為靶點的抗腫瘤藥物研發是當前的研究熱點。迄今為止，美國FDA批準上市的28種小分子激酶抑制劑靶向藥物中，超過80%為酪氨酸激酶抑制劑[8]。因此，通過對蛋白質酪氨酸磷酸化的規模化研究，獲得其對應激酶活性和相關信號通路的信息，對于抗腫瘤藥物的研發與臨床應用具有重要意義。

隨著質譜技術的不斷發展，基于質譜的蛋白質翻譯后修飾的規模化鑒定也日臻成熟。但蛋白質酪氨酸磷酸化的質譜分析依然面臨巨大挑戰。在生物體內，酪氨酸磷酸化修飾含量極低（在磷酸化修飾中，S/T/Y的比例為1800∶200∶1[9]）。質譜鑒定時，大量非酪氨酸磷酸化肽段會對酪氨酸磷酸肽的信號造成干擾和抑制。因此，在分析復雜樣本時，對酪氨酸磷酸肽進行選擇性富集是質譜鑒定前樣本處理的關鍵步驟。目前，應用于酪氨酸磷酸化修飾肽段的富集方法主要有免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）[10～13]、固相金屬離子親和色譜（Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）[14，15]和金屬氧化物親和色譜（Metal oxide affinity chromatography，MOAC）[16～18]等。其中最常用的是抗體免疫沉淀富集。但實際樣本高度的復雜性和抗酪氨酸磷酸化抗體有限的親和力嚴重限制了富集的選擇性和鑒定規模。MOAC常應用于磷酸肽的富集鑒定。其中，二氧化鈦（TiO2）法因其操作簡便、富集效果好、成本低，應用最為廣泛。然而，該方法依然存在一些亟待解決的問題： 所需樣品起始量大、實驗步驟繁瑣、極為費時費力、結果重現性較低、對酪氨酸磷酸肽無針對性富集、鑒定規模有限等。

針對上述問題，本研究構建了TiO2串聯反相填料的離心式富集裝置，結合抗體免疫沉淀，建立了蛋白質酪氨酸磷酸肽的富集策略。此策略首先通過新型富集裝置將磷酸肽從復雜樣品中富集出來，并將富集產物分離為不同餾分，大幅降低體系的復雜程度； 再通過抗體進一步特異性富集酪氨酸磷酸肽，從而實現酪氨酸磷酸肽的大規模質譜鑒定。不同于常規的磷酸肽富集方法，此新型富集裝置通過自制的TiO2和反相填料裝填小柱將磷酸肽的富集和反相分離有機結合，并以離心方式進行樣品的上樣、清洗、洗脫和分離， 不僅精簡了實驗步驟，減少了樣品損失，而且降低了實驗的勞動強度和人為因素干擾，非常適用于大規模、微量臨床樣品的酪氨酸磷酸肽分析。將此策略應用于小鼠肝臟蛋白質的酪氨酸磷酸化規模化研究，共計富集鑒定酪氨酸磷酸肽849個，對應967個酪氨酸磷酸化位點和545個蛋白，為蛋白質酪氨酸磷酸化的生理功能研究和癌癥治療靶點篩選提供了技術支持。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Orbitrap Fusion MS四極桿靜電場軌道阱線性離子阱三合一組合式質譜、EasynLC 1000液相色譜、FRESCO 21高速離心機、RVT5105真空冷凍干燥機（美國Thermo Fisher Scientific公司）； BP211d分析天平（德國Sartorius公司）； SBH200D金屬浴加熱儀（英國Stuart公司）； JY92Ⅱ超聲波細胞破碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）； 純水系統（美國Millipore公司）。

cOmpleteTablets蛋白酶抑制劑、PhosSTOP磷酸酶抑制劑（純度99.9%， 德國Roche公司）； 測序級胰蛋白酶（Trypsin，純度99.9%）、1，4二硫蘇糖醇（DTT，純度99%）及碘乙酰胺（IAA，純度98%， 美國Promega公司）； 尿素（純度99.0%）、色譜純乙腈（ACN，純度99.9%）、氨水（濃度61.7%， 美國SigmaAldrich公司）； 三氟乙酸（TFA，純度99%，比利時Acros公司）； N2羥乙基哌嗪N2乙磺酸（HEPES，純度99%，美國Amresco公司）； 二氧化鈦顆粒（日本GL Sciences公司）； C8、C18膜（美國3M公司）； C18反相填料（粒徑3 μm，Agela Technologies公司）； PTM703抗酪氨酸磷酸化抗體（杭州景杰生物科技有限公司）； PTyr100抗酪氨酸磷酸化抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。endprint

2.2 小鼠肝臟蛋白質的提取和酶解處理

2.2.1 小鼠肝臟蛋白質提取 取10周齡SPF級C57BL/6小鼠的肝臟于離心管（EP管）中，加入配制好的尿素裂解液（9 mol/L尿素，20 mmol/L HEPES緩沖溶液，加入適量蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），使用高通量組織研磨器破碎組織后， 將樣品置于冰上，使用超聲破碎儀進行蛋白質提取，取上清液，備用。

2.2.2 蛋白質酶解 取5 mg鼠肝蛋白，用尿素裂解液（9 mol/L 尿素，加入適量蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑）稀釋1倍，在溶液中加入DTT（終濃度4.5 mmol/L），55℃金屬浴孵育30 min。冰上冷卻至室溫后，加入10 mmol/L IAA充分混勻，室溫避光靜置30 min。用20 mmol/L HEPES緩沖液將所得蛋白溶液稀釋4倍后，按胰蛋白酶和蛋白質1∶100 （m/m）加入胰蛋白酶，37℃酶解過夜后，使用SepPak C18柱將產物肽段脫鹽，凍干。

2.3 磷酸肽富集與分離

2.3.1 TiO2填料裝填富集吸頭和C18反相填料裝填分離吸頭的制作 取200 μL移液器吸頭，每只吸頭裝填4 mg TiO2填料和1層C8膜； 取10 μL超長吸頭，裝填3層C18膜、3 mg C18反相填料； 分別以200 μL乙腈和200 μL 15%氨水平衡富集和分離吸頭。

2.3.2 磷酸肽的富集與分離 使用200 μL Binding 緩沖液（64% ACN+20%乳酸+ 4%TFA，V/V）溶解5 mg肽段，并轉移至TiO2富集吸頭中。將TiO2富集吸頭固定在裝有適配器的EP管中，500 g 離心。收集EP管中的流穿液，重復上樣，共富集3次。采用200 μL Washing 緩沖液（80% ACN+5% TFA，V/V）清洗， 去除非磷酸肽，重復3次。將TiO2富集吸頭插入C18分離吸頭中，將二者串聯結合，并固定于新的帶有適配器的EP管。依次加入梯度洗脫液各200 μL： （1）15%濃氨水，500 g 離心； （2）2% ACN+98%（15%濃氨水），500 g 離心； （3）5% ACN+95%（15% 濃氨水），500 g 離心； （4）8% ACN+92%（15% 濃氨水），500g 離心； （5）10% ACN+90%（15% 濃氨水），500 g 離心； （6）40% ACN+60%（15% 濃氨水），500 g 離心。分別收集梯度洗脫的流穿液，兩兩合并： 2%+8% ACN、5%+10% ACN、0+40% ACN，凍干，

2.4 抗體富集酪氨酸磷酸化肽段 分別取兩種固載抗酪氨酸磷酸化抗體的微球各15 μL，混合置于EP管中。將凍干的磷酸肽溶解于100 μL IP緩沖液（50 mmol/L TrisHCl，50 mmol/L NaCl， pH 6.9）中，與抗體微球混合后于4℃混懸過夜。之后使用300 μL IP緩沖液，反復清洗3次， 去除非酪氨酸磷酸肽。加入100 μL 0.15% （V/V） TFA洗脫所富集的酪氨酸磷酸肽，脫鹽凍干后80℃保存。

2.5 質譜鑒定及數據處理

質譜條件： 正離子掃描模式； 電噴霧電壓為2.2 kV，一級質譜分辨率為120000，一級AGC為5.0×105，最大離子注入時間為50 ms，全掃描質荷比范圍為300～1400； 二級質譜母離子的選擇采用數據依賴模式，HCD碰撞能量設定為32%，AGC為1.0e2，最大離子注入時間為250 ms，動態排除時間設為18 s，質譜采集時間為78 min。

數據檢索條件： 采用Proteome Discoverer 1.4軟件，以Mascot搜索引擎對數據進行檢索，蛋白酶切類型選擇Trypsin，允許最大肽段漏切位點數設為2，一級搜索質量偏差 ≤15 ppm， 二級搜索質量偏差≤0.5 Da，固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Oxidation（M）、 Acetyl（protein Nterm）、 Phosphorylation（ST）和Phosphorylation（Y）。肽段水平假陽性率（FDR）≤1%。

3 結果與討論

3.1 磷酸化肽段的富集策略

復雜生物樣本中蛋白質酪氨酸磷酸化的規模化鑒定是蛋白質組學研究的難點。常規的酪氨酸磷酸肽富集鑒定策略通常采用強陽離子交換色譜（SCX）將肽段樣品分離為多個餾分，再對每個餾分分別進行磷酸肽富集和抗體免疫沉淀，最后進行質譜檢測[19]。這種方法可顯著降低樣本的復雜性，提高富集效率； 但起始樣本需求量大，步驟繁瑣，且質譜檢測耗時長。為了解決此問題，本研究構建了TiO2串聯反相填料的富集裝置，將磷酸肽的富集和分離有機結合，并通過離心的方式實現了簡便、快捷、高通量的磷酸肽富集、洗脫和分離。此裝置包括裝填TiO2和C8膜的富集吸頭，裝填C18膜和C18反相填料的分離吸頭，以及裝有適配器的EP管收集器（圖1A）。使用時，首先將肽段樣品上樣到固定于EP管收集器的富集吸頭中（圖1B），并清洗去除非磷酸肽； 再將富集吸頭與分離吸頭串聯固定（圖1C），將所富集的磷酸肽洗脫并保留在串聯的分離吸頭中； 最后采用不同乙腈含量的堿性洗脫液梯度洗脫，分離得到6個餾分，并交叉合并為3個餾分，分別進行質譜鑒定。此策略將經TiO2富集后，

圖1 新型離心式磷酸肽富集與分離裝置圖。A 裝置分解圖； B 富集裝置； C 分離裝置

Fig.1 A new centrifugal device for phosphopeptides enrichment and separation： （A） An assembled view of the device， （B） enrichment device and （C） separation deviceendprint

氨水洗脫的磷酸肽直接串聯高pH反相分離，從而將磷酸肽的富集與分離有機結合。避免了常用的SCX分離中，肽段脫鹽和凍干等一系列繁瑣的實驗操作步驟和樣本損失。同時，高pH反相分離與液相色譜質譜聯用時使用的低pH反相分離具有良好的正交性，能夠有效降低富集產物的復雜程度，提高磷酸肽的質譜鑒定效果[20]。采用此裝置，以1 mg鼠肝蛋白為樣品，在一次實驗的3個餾分中分別鑒定到3269、2918和3217個磷酸肽（表1）。通過韋恩圖（圖2A）分析可知，77.7%的磷酸肽只在1個餾分中被鑒定到，說明了此裝置可對磷酸肽高效富集分離。3個餾分共鑒定到10793個磷酸化位點，對應7333個非冗余磷酸肽。同樣條件下，未經餾分分離而直接進行質譜鑒定， 只能得到3405個磷酸肽，富集選擇性為74.0%，說明分餾策略可以在保證富集選擇性的前提下顯著提高磷酸肽的鑒定規模。將分餾后的餾分交叉合并，可將色譜保留行為差異較大的肽段混合，有效提高分餾與后續液相色譜質譜鑒定中色譜分離的正交性，比采用順序合并更能使肽段均勻分布在整個色譜梯度洗脫的范圍內，充分利用質譜的掃描時間，從而達到縮短質譜分析時間的目的[13，21，22]。使用此裝置，3次重復實驗分別鑒定到7333、7587和7962個磷酸化肽段，富集選擇性為71.9%±2.4%。其中50.2%的磷酸肽至少在兩次實驗中被鑒定到（圖2B）。此外，此富集分離裝置與實驗室常用離心機兼容性良好，通過離心式操作，可大大減輕實驗者勞動強度，并可同時平行處理高達24個樣品，顯著提高了樣品處理的通量。

3.2 小鼠肝臟蛋白質酪氨酸磷酸化修飾蛋白質組分析

在上述方法學研究的基礎上，本研究對復雜的生物樣本小鼠肝臟的蛋白質酪氨酸磷酸化修飾蛋白質組進行了分析。由于生物體內酪氨酸磷酸化肽段含量極低，其在TiO2富集產物中仍屬于低豐度肽段，在質譜鑒定時易受到其它非酪氨酸磷酸肽的抑制，鑒定比例通常不超過總磷酸肽數量的1%。因此， 本研究對通過新型富集裝置所得的總磷酸肽使用抗酪氨酸磷酸化抗體進行進一步的針對性富集，完整實驗流程見圖3。采用此新型富集分離策略，以5 mg鼠肝蛋白為樣品，3次重復實驗分別鑒定到482，429和564個酪氨酸磷酸肽，合計酪氨酸磷酸化位點達到967個，對應545個蛋白質。本研究同樣以5 mg鼠肝蛋白為樣品，單純使用抗酪氨酸磷酸化抗體富集，經質譜鑒定得到酪氨酸磷酸化位點127個，對應106個蛋白質。與單純使用抗酪氨酸磷酸化抗體富集的鑒定結果相比，修飾位點和蛋白質鑒定規模分別提高6倍和4倍。上述結果表明，此分析策略對于微量樣本中蛋白質酪氨酸磷酸化富集鑒定的高效性。采用生物信息學工具DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對鑒定到的545個酪氨酸磷酸化蛋白進行了GO注釋分析[23]。通過對蛋白質的亞細胞定位進行分析可知，鑒定到的蛋白主要集中在外泌體、細胞液和細胞質中（圖4A）。對蛋白質參與的生物學過程進行分析發現，鑒定到的酪氨酸磷酸化蛋白質主要參與細胞的代謝過程、氧化還原過程和磷酸化過程（圖4B）。蛋白分子功能則主要包括細胞粘附、氧化還原和催化等（圖4C）。上述分析與文獻[4，5]報道的酪氨酸磷酸化蛋白的主要功能相符，驗證了鑒定結果的可靠性。

4 結 論

本研究建立了一種可用于復雜樣本中酪氨酸磷酸化修飾蛋白質的規模化鑒定的富集新策略。通過TiO2串聯反相填料的新型離心式富集裝置，將磷酸肽的富集和分離有機結合，實現了簡便、快捷、平行化的磷酸肽富集和分離。在此基礎上，采用抗酪氨酸磷酸化抗體對酪氨酸磷酸化肽段進行進一步針對性富集，結合質譜鑒定，成功實現了小鼠肝臟的酪氨酸磷酸化蛋白質組分析。實驗結果表明，本研究建立的技術策略在翻譯后修飾蛋白質組的高通量富集與鑒定研究中具有良好的應用潛力。endprint