基于主客體競爭模式的凝血酶適配體傳感器的研究

姚雪蓮+陳查丹+張晶+崔漢峰+林艷+洪年+何玲玲+孔德榮+樊浩+程林

摘 要 基于β環糊精（βCD）主客體競爭模式，構建了開關型凝血酶適配體電化學傳感器。將末端修飾了二茂鐵（Fc）的核酸適配體通過與βCD的主客體識別固定在金電極表面，當凝血酶存在時，適配體由原來的直立線狀構型變為“G四鏈體”，遠離電極表面，適配體探針的氧化還原電流強度減小，即“Signaloff”。利用此效應對凝血酶進行了靈敏檢測，結果表明，在5.0×10mol/L（3σ）。與其它蛋白分子相比，本方法對凝血酶蛋白的檢測具有高特異性。本傳感器構建簡單，再生性好，為生物血清樣本中凝血酶的實時高效檢測提供了方法。

1 引 言

凝血酶是一種重要的凝血系統絲氨酸蛋白酶，在傷口愈合、血管止血、炎癥、組織黏合、動脈硬化等過程中發揮了重要作用[1，2]。此外，凝血酶對腫瘤細胞的生長具有調節作用，濃度較低時促進生長，濃度較高時抑制其生長，甚至產生凋亡效應[3]，在激活正常細胞的致瘤性和惡性細胞轉移方面也扮演著重要角色[4，5]。凝血酶含量是衡量機體凝血功能異常一種指標，因此，建立靈敏、快速檢測凝血酶的方法對疾病診斷具有重要意義。

適配體（Aptamer）可與目標物高特異性、高選擇性結合，具有易合成、易修飾、高穩定性、配體廣泛、無免疫原性、易儲存等優點[6]，基于適配體的傳感方法近年來得到廣泛應用[7～12]。很多文獻報道了利用適配體構建的凝血酶電化學傳感器 [13～19]。Gao[20]等設計了一種三明治型凝血酶適配體電化學傳感器，將巰基化的一條適配體固定在金電極表面，形成適配體凝血酶復合物，并與另一條修飾了Pt NPs/CNCs的適配體結合，通過納米粒子催化H2O2的電化學還原產生陰極電流，對凝血酶實現放大檢測，檢出限為1.0×10

mol/L。Wang等[21]基于金納米粒修飾的au@GS和CoPd NPs，用巰基標記的探針作為捕獲探針，生物素標記的探針作為報道探針，形成的夾層結構對凝血酶的檢出限低至5 pg/mL。這些方法雖然能有效放大信號，但是檢測過程中需多步識別，操作過程復雜。有研究者利用電活性標記物在電極表面的電子傳遞構建了“Signalon”開關型凝血酶電化學傳感器，如Radi[22]和Katakis[23]等將Fc標記的適配體通過巰基固定在金電極表面，適配體與凝血酶結合后，形成剛性的“G四鏈體”結構而靠近電極表面，電化學信號增大，從而實現對凝血酶的檢測。Xiao等[24]設計了同樣檢測原理的凝血酶傳感器，利用適配體凝血酶的特異性結合，使適配體上標記的亞甲基藍（MB）與電極表面接近，使信號增強， 2.56×10mol/L的凝血酶響應信號約為空白的270%。此類傳感器是通過與凝血酶識別前后標記物與電極表面距離發生的改變而導致電信號的改變進行測定，雖然構建簡便，但電化學標識物的電子傳遞受到了適配體鏈長度的限制，因而對靈敏度有所影響。

環糊精是直鏈淀粉在環糊精葡萄糖基轉移酶作用下所生成的系列環狀低聚糖的總稱，通常含6～12個D吡喃葡萄糖單元，其中βCD是研究較多的含有7個葡萄糖單元的分子。環糊精分子具有類似錐形的中空圓筒腔體結構，內部是疏水空腔而外部是親水環形。其特殊的腔體結構使得環糊精具有突出的識別和包絡客體分子的能力，如有機分子、無機離子等，這種主客體間的識別作用能使分子形成良好組裝體系，在醫藥、分析、化工、環保等研究領域受到廣泛關注[25]。本研究利用βCD與Fc的主客體識別原理，構建了一種“Signaloff”的開關型適配體傳感器，用于凝血酶的檢測。3′標記Fc的抗凝血酶適配體利用βCD與Fc客體的識別作用組裝到修飾βCD的電極表面（實驗原理見圖1），在凝血酶不存在時，由于Fc在電極表面發生氧化還原給出電化學響應信號； 凝血酶存在時，與適配體特異性結合，適配體構型發生改變，離開電極表面，電子傳遞受阻，信號減弱。本方法中，適配體與凝血酶結合后標記物直接脫離電極表面，檢測信號不受適配體鏈長度的影響，因此靈敏度高。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

AUTOLAB電化學工作站（瑞士萬通儀器有限公司）； 采用三電極體系：金電極（直徑1.0 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極（飽和KCl）為參比電極，鉑電極為對電極； 400 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker科技有限公司）。

βCD（SigmaAldrich公司）； 凝血酶、牛血清白蛋白（BSA）、溶血酶（生工生物工程（上海）股份有限公司）； 核酸適配體序列：3′FcGGTTGGTGTGGTTGG5′（大連寶生物工程有限公司）； 所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水（美國Millipore公司超純水系統）制備。

2.2 SHβCD的合成

參照文獻[26]，將βCD （1.10 g， 1.0 mmoL）加入含三苯基膦（5.20 g， 20 mmoL）和碘（5.05 g， 20 mmoL）的20 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，混合體系在氮氣保護下80℃磁力攪拌15 h，將反應液濃縮約1/2，使得pH=9.0～10.0，再加入甲醇鈉的甲醇溶液 （3 moL， 8.0 mL）中，冷卻后在室溫下放置30 min，以破壞在反應中形成的酯類，加入100 mL冰甲醇和500 mL冰水環境下產生沉淀，收集沉淀，用冰水和甲醇沖洗，干燥后得到白色粉末（6IβCD）（1.56 g，82%）。

取6IβCD（1.56 g， 0.82 mmoL）、硫脲（0.48 g， 6.4 mmoL） 溶于16 mL DMF中，氮氣保護下70℃反應19 h后，減壓除去DMF，再加入NaOH（0.42 g， 1.05 mmol/L），氮氣氛下加熱回流1 h后，用水合KHSO4過濾沉淀，用蒸餾水洗滌，干燥除去殘留的DMF。在得到的懸浮液中加入少量NaOH使澄清，加入KHSO4產生沉淀，經過濾真空干燥后得到白色粉末（0.85 g，83%），即6SHβCD，所得1H NMR化學位移為：δ 5.92（d， J=6.0 Hz， 7 H）， 5.82（s， 7 H）， 4.93（s， 7 H）， 3.68（t， J=6 Hz， 7 H）， 361（t， J=7.5 Hz， 7 H）， 3.19（brd， J=15 Hz， 7 H）， 2.77～2.74（m， 7 H）， 2.13（t， J=6.0 Hz， 7 H）， 如圖2。endprint

2.3 傳感器的制備

分別用0.30和0.05 μm Al2O3粉末打磨金電極，用超純水超聲清洗后在0.5 mmoL/L H2SO4中進行循環伏安掃描（掃描電壓

0.01 mol/L SHβCD溶液中，4℃孵育2 h。修飾后的電極用20 mmol/L TrisHCl緩沖液（pH 7.4）清洗，氮氣流下干燥，再將電極浸泡在3.0×10

mol/L適配體乙醇（1∶1，V/V）的溶液中12 h，將適配體組裝到電極表面，用超純水清洗后于氮氣流下干燥，即制得傳感器。

2.4 凝血酶的檢測

在TrisHCl緩沖液中，將制備的適配體傳感器用示差脈沖伏安法（DPV）進行電位掃描（掃描范圍0.2～0.6 V，增量0.001 V，脈沖振幅0.05 V，掃描速率0.002 V/s），記錄峰電流的大小。然后在緩沖液中加入凝血酶，37℃下孵化5 min后，測量DPV峰電流大小，加入凝血酶前后峰電流變化的差值可用于定量檢測凝血酶。

3 結果與討論

3.1 主客體識別的驗證

為了研究βCD的主客體識別特性，分別將裸金電極和SHβCD修飾的金電極浸泡在濃度為1.0×10

mol/L Fc溶液中10 min后，在TrisHCL緩沖液中進行DPV掃描。結果表明，裸電極在0.2 V附近未觀察到Fc的氧化還原峰（圖3 曲線a），說明Fc未吸附在電極表面； 修飾了SHβCD的金電極則在1.1 μA處產生了明顯的氧化還原峰（圖3 曲線b），證明基于βCD和Fc的主客體識別作用使大量的Fc

固定于金電極表面。

3.2 修飾電極的電化學阻抗表征

采用電化學阻抗對電極的組裝和監測過程進行了表征，如圖4所

示，裸金電極作為一個理想的導體在阻抗譜

中的高頻部分出現一個小半圓（曲線a），其直徑相當于電子轉移阻抗（Ret）； 用SHβCD修飾電極后，金電

在金電極表面的電子交換，Ret值從裸電極的345 Ω增加到990 Ω（曲線b）； 將適配體組裝到電極表面后，電極表面與氧化還原探針間的負電荷相互排斥，阻礙了電子傳遞，使得Ret值繼續增大至1300 Ω（曲線c），表明適配體組裝成功； 與5.0×mol/L凝血酶作用后，適配體的構型發生改變離開電極，少數未反應部分仍留在電極表面，因而電極的Ret阻抗值減小為1140 Ω（曲線d）。

3.3 傳感器的分析性能

將制備的適配體傳感器分別與0、5.0×10mol/L的凝血酶作用，發現隨著凝血酶濃度的增加，DPV信號強度從1.0 μA降至0.1 μA（如圖5 a～f）這是因為不同濃度的凝血酶與適配體結合后構型改變，Fc標記物遠離電極表面，電子傳遞阻礙越來越大，表現為電流信號減弱。對響應信號進行線性回歸，在5.0×10 mol/L范圍內，凝血酶濃度與信號響應值呈負相關（圖5插圖），線性回歸方程為y=-0.1577lgx-1.1885， 相關系數r=0.9949， 檢出限為2.0×10

3.4 傳感器的特異性

考察了傳感器對其它蛋白分子的響應，用傳感器分別檢測TrisHCl緩沖液、5.0×10mol/L BSA、5.0×10mol/L 溶血酶、5.0×10mol/L凝血酶，如圖6中a～d，結果表明，只有凝血酶的一組的信號明顯減小。在5.0×10mol/L凝血酶中分別混合了10和100倍于凝血酶濃度的BSA、溶血酶、BSA和溶血酶，發現并未干擾凝血酶的測定，檢測到的信號峰無明顯變化（圖6中e～j），表明此傳感器對凝血酶的檢測不受其它共存蛋白分子的影響，可實現凝血酶的特異性檢測。

3.5 實際血清樣本分析

為了研究此傳感器的實際應用性能，用江西中醫藥大學附屬醫院健康志愿者血清樣本（江西中醫藥大學附屬醫院）進行了加標回收實驗。將5 μL血清樣本用TrisHCl緩沖液稀釋10倍后，再分別加入不同濃度的凝血酶，實驗結果見表1，回收率為95.5%～104.1%，RSD為4.8%～8.0%，可滿足對實際樣本的高效檢測的要求。

mol/L凝血酶進行再次檢測， 發現DPV信號與再生之前基本一致，如圖7所示，在連續再生6次后的電極響應基本不變。構建的分子識別型傳感器與目標物結合后，Fc隨著適配體離開電極表面，再次使用時，識別過程不受影響，表現出良好的再生性。

4 結 論

本研究構建的基于主客體競爭模式的適配體傳感器成功實現了對凝血酶的高效檢測，適體探針與目標物凝血酶結合后，脫離電極，使得信號變化最大化，克服了以往這類傳感器靈敏度受限制的缺點。同時，相比于通過金硫鍵固定適體構建的傳感器，使用主客體識別修飾電極，更容易使傳感器再生。 此傳感器制備簡單，操作簡endprint