核酸適配體比色法檢測恩諾沙星

趙銀麗 王金榮 蘇蘭利

（河南工業大學生物工程學院，河南鄭州 450001）

核酸適配體比色法檢測恩諾沙星

趙銀麗 王金榮 蘇蘭利

（河南工業大學生物工程學院，河南鄭州 450001）

（目的）研究檢測恩諾沙星的膠體金核酸適配體比色法，（方法）將恩諾沙星核酸適配體與膠體金結合后形成膠體金適配體復合物，然后加入恩諾沙星靶標分子，由于核酸適配體與靶標的高效特異性結合，核酸適配體與膠體金解離。最后加入NaCl后，膠體金由紅變蘭。（結果）膠體金比色檢測體系中，NaCl的最佳濃度為1M，核酸適配體的最佳濃度為2μM。對恩諾沙星的比色檢測限為 15ng/mL。（結論）基于膠體金和核酸適配體的比色法可用于恩諾沙星的快速篩選。

恩諾沙星；膠體金；核酸適配體；檢測

恩諾沙星是動物專用的氟喹諾酮類藥物，主要用于治療畜禽細菌性疾病和支原體感染。但恩諾沙星的廣泛應用造成了藥物在動物體內的殘留，如果人類長期食用含低殘留的恩諾沙星食品，會對人類健康造成一定的危害。因此，通過有效的技術手段對動物組織中有關藥物殘留量進行檢測是非常必要的。本研究利用恩諾沙星的核酸適配體，建立了基于膠體金和核酸適配體的檢測恩諾沙星的比色法。

1 材料和方法

1.1 材料

恩諾沙星，環丙沙星，諾氟沙星，由中國獸醫藥品監察所提供；氯金酸（HAuCl4），檸檬酸三鈉，氯化鈉，由中國醫藥上海化學試劑公司提供。恩諾沙星的核酸適配體序列5’- CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA -3由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 檸檬酸鈉還原法制備膠體金

將氯金酸配制成1%的母液，低溫避光保存備用。用1%的氯金酸母液配制100ml 0.01%的氯金酸水溶液，用電爐加熱至沸騰狀態時，攪拌下均勻加入2.5 ml 1%的檸檬酸三鈉，繼續煮沸15min，然后室溫冷卻，得膠體金。

1.2.2 NaCL工作濃度的選擇

向100μl膠體金溶液中加入20μl不同濃度的NaCl溶液（0 M、0.5M、1M、2M），然后加入100μl雙蒸水，使體系總體積為220μl。觀察膠體金顏色的變化，以凝聚膠體金變蘭的濃度作為工作鹽濃度。

1.2.3 核酸適配體ssDNA工作濃度的選擇

向對照管中加入100μl膠體金和50μl滅菌雙蒸水；向實驗管中加入 100μl膠體金和50μl 不同濃度的ssDNA（0、1、2、4μM）。室溫下孵育10min，然后各加入20μl NaCl（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化，根據其對膠體金的保護效果確定ssDNA的工作濃度。

1.2.4 核酸適配體比色法檢測恩諾沙星

首先向每個反應管中加入100μl 膠體金和 50μl ssDNA，室溫孵育10min，然后向對照管中加入50μl 滅菌的雙蒸水，向實驗管中加入不同濃度的恩諾沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室溫下繼續孵育10min，然后向所有管中各加入20μl NaCl（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化。

1.2.5 核酸適配體比色法對恩諾沙星檢測的特異性

首先向每個反應管中加入100μl 膠體金和 50μl ssDNA，室溫孵育10min，然后向對照管中加入50μl 滅菌的雙蒸水，向實驗管中加入不同濃度的恩諾沙星、環丙沙星和諾氟沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室溫下繼續孵育10min，然后向所有管中各加入20μl NaCl（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化，確定其檢測的特異性。

2 結果

2.1 NaCl工作濃度的選擇

向膠體金中加入不同濃度的NaCl鹽溶液（0 M、0.5M、1M、2M），觀察膠體金顏色的變化。結果見圖1.從結果來分析，膠體金溶液隨著NaCl添加濃度的增加，呈現從紅到紫、再到藍色的變化。與對照管膠體金相比，0.5M 的NaCl溶液使膠體金變紫，1M的NaCl溶液使膠體金變蘭。所以，1M 的NaCl溶液作為下一步實驗的選擇濃度。

圖1 凝聚膠體金溶液變蘭的鹽工作濃度選擇

2.2 核酸適配體ssDNA工作濃度的選擇

向對照管中加入膠體金和滅菌水，向實驗管中加入膠體金和不同濃度的ssDNA（0、1、2、4μM）。孵育后各加入NaCl（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化。從結果分析，添加2μM ssDNA實驗管中的膠體金溶液顏色沒有變蘭，說明可以保護膠體金。所以確定2μM ssDNA 為工作濃度。結果見圖2.

圖2 核酸適配體ssDNA工作濃度的選擇

2.3 膠體金核酸適配體比色法檢測恩諾沙星的靈敏性

每個反應管中加入 膠體金和 ssDNA，室溫孵育10min，然后向對照管中加入滅菌水，向實驗管中加入不同濃度的恩諾沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室溫下繼續孵育10min，然后向所有管中各加入 NaCL（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化，結果見圖3.同對照管相比，添加不同濃度的恩諾沙星的實驗組，發生了顏色變化。并且隨著濃度的增加顏色從紅色向紫色、藍色變化。通過肉眼觀察，15ng/ml 實驗管顏色明顯變蘭，可作為肉眼比色的檢測限。

圖3 膠體金核酸適配體比色法檢測恩諾沙星的靈敏性

2.4 膠體金核酸適配體比色法檢測恩諾沙星的特異性

每個反應管中加入 膠體金和 ssDNA，室溫孵育10min，然后向對照管中加入滅菌水，向實驗管中加入不同濃度的恩諾沙星、環丙沙星和諾氟沙星（0，1，5，10，15，30 ng/ml），室溫下繼續孵育10min，然后向所有管中各加入 NaCL（1M），觀察膠體金溶液的顏色變化，結果見圖4。

同對照管相比，添加不同濃度的恩諾沙星的實驗組，發生了顏色變化。并且隨著濃度的增加顏色從紅色向紫色、藍色變化。通過肉眼觀察，15ng/ml 實驗管顏色明顯變蘭，可作為肉眼比色的檢測限。而添加環丙沙星和諾氟沙星的實驗組（0，1，5，10，15，30 ng/ml），沒有發生顏色的變化。說明，在 1～30 ng/ml 濃度范圍下，此檢測方法只對恩諾沙星敏感。也說明了對恩諾沙星檢測的特異性。

圖4 膠體金核酸適配體比色法檢測恩諾沙星的特異性

3 討論

目前，對于恩諾沙星的檢測主要有色譜法和免疫學方法。色譜法需要昂貴的儀器和專門的人員，樣品前處理也較煩瑣，在基層大規模篩選中應用受到一定的限制，常作為確證方法使用。而以抗體為核心試劑建立的免疫學方法，簡便、快速，常作為篩選方法使用。適配體作為一種單鏈DNA 分子，可以吸附在納米金表面，保護納米金免于高鹽引起的納米金團聚。當加入對應的靶標時，適配體與靶標結合，從納米金上解離，失去保護的納米金在高鹽濃度下發生團聚，溶液顏色由紅變為紫色或藍色，而且顏色的變化與加入靶標的濃度成正比，可用于很多種物質的檢測。納米金比色法具有結果肉眼可見、無需復雜儀器測量。納米金比色法在毒素、四環素、磺胺藥的檢測中得到了應用。本研究中，基于膠體金和適配體的比色法可以實現對恩諾沙星的檢測。

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河南省科技攻關項目（152102210263）

趙銀麗（1973—），女，山東莘縣人，副教授，博士，主要從事獸藥殘留檢測研究。