不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病模型大鼠的保護作用

劉靑　朱萱萱　王瓊

[摘要] 目的 比較不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病模型大鼠的保護作用。 方法 選用健康SD鼠54只，雄性，8周齡。采用高糖高脂飼料+單側腎臟結扎術+腹腔注射STZ（40 mg/kg）的方法建立糖尿病腎病模型，造模成功后將其分為五組：模型組、厄貝沙坦組、工藝1組（水煮濃縮方）、工藝2組（水煮醇提濃縮方）、工藝3組（水提醇提濃縮合并方），另設空白組。三種不同工藝芪葵顆粒以相同劑量18.67 g/kg分別于造模成功后連續給藥5周，觀察不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病大鼠血糖、尿蛋白、肌酐、內生肌酐清除率的影響，并行病理組織學檢查。 結果 與空白組比較，模型組大鼠體重顯著降低（P < 0.01），進食量、飲水量、尿量明顯增加（P < 0.05或P < 0.01），血糖明顯升高（P < 0.01）。給藥干預后，與模型組比較，各給藥組體重不同程度增加，進食量、飲水量、尿量不同程度減少；工藝2組和工藝3組血糖明顯降低（P < 0.05）；厄貝沙坦組和工藝3組血肌酐明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）；各給藥組內生肌酐清除率明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）；厄貝沙坦組以及工藝2、3組尿蛋白排泄率明顯降低（P < 0.01或P < 0.05）。病理組織學結果顯示，模型組大鼠腎臟主要表現為腎小球肥大、腎小管擴張、間質及腎盂炎細胞灶性浸潤；與模型組比較，各給藥組腎臟病變范圍和程度略有減輕，以厄貝沙坦組和工藝2組腎小球和腎小管病變減輕略為明顯。 結論 不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病的保護作用與降低血糖、肌酐和尿蛋白排泄和減輕腎臟病變有關。以工藝2組與工藝3組較為明顯。

[關鍵詞] 糖尿病腎病；芪葵顆粒；血糖；肌酐清除率；尿蛋白排泄率；病理組織學

[中圖分類號] R285.5；R587.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（a）-0025-06

[Abstract] Objective To compare the protective effects of different processes of Qikui Particles for model rats with diabetic nephropathy. Methods Fifty-four healthy SD rats （male， 8 weeks old） were selected. The model rats with diabetic nephropathy were induced by high sugar/fat diet + unilateral nephritic ligation + Streptozotocin （STZ， 40 mg/kg， ip）. After successful establishment of model rats， they were divided into 5 groups： model group， Irbesartan group， process 1 （water boiled concentrated decoction） group， process 2 （water boiled and alcohol extraction concentration） group， process 3 （the mixed of above two processes） group， and the blank group was set up. Qikui Particles prepared under 3 different processes were orally administered at the same dose （18.67 g/kg ） for 5 consecutive weeks. The effects of different processes of Qikui Particles on blood sugar， urinary protein， creatinine and endogenous creatinine clearance rate in rats with diabetic nephropathy were observed， and histopathology was detected. Results Compared with blank group， the body weight in model group was decreased significantly （P < 0.01）， the food-intake， water consumption and urine volume were increased （P < 0.05 or P < 0.01）， the blood sugar was improved significantly （P < 0.01）. After drug intervention， compared with model group， the body weight in each drug administration group was increased more or less， the food-intake， water consumption and urine volume were decreased more or less； the blood sugar in process 2 group and process 3 group was decreased significantly （P < 0.05）； the serum creatinine in Irbesartan group and process 3 group was decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）； the endogenous creatinine clearance rate in each drug administration group was increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）； the urinary protein excretion rate in Irbesartan group and process 2， 3 group was decreased significantly （P < 0.01 or P < 0.05）. The results of histopathology showed that the main performance of kidney in model groups was glomerular hypertrophy， tubular dilation， interstitial and renal pelvis focal infiltration of inflammatory cells； compared with model group， the scope and extent of renal injury were reduced slightly in each drug administration group， especially in Irbesartan group and process 2 group. Conclusion The protective effects of different processes of Qikui Particles for diabetic nephropathy are related to the decrease of blood sugar， creatinine， urinary protein and alleviation of renal injury， especially in process 2 group and process 3 group.endprint

[Key words] Diabetic nephropathy； Qikui Particles； Blood sugar； Creatinine clearance rate； Urinary albumin excretion rate； Histopathology

糖尿病腎病是糖尿病常見的慢性并發癥之一，在糖尿病人群中的發生率為20%～40%，是糖尿病致命的主要原因。目前我國糖尿病腎病發病率也呈逐年增多趨勢，越來越成為亟待解決的腎臟病變。對糖尿病腎病的防治已成為國內外研究的熱點[1]。因此，對糖尿病腎病進行早期診斷，并采取有效措施延緩其發展至關重要。芪葵顆粒是江蘇省中醫院（以下簡稱“我院”）醫療機構制劑，來源于內分泌名中醫余江毅主任的經驗方，由黃芪、黃蜀葵花等中藥組成，具有健脾胃、補肝腎的功能，臨床上用于治療糖尿病腎病，療效顯著。臨床研究表明，芪葵顆粒對糖尿病腎病陰虛絡瘀證患者蛋白尿水平有較好的療效，能夠顯著改善糖尿病腎病患者的臨床進程[2-4]。然而，目前的研究對于芪葵顆粒改善糖尿病腎病及其相關病變的主要作用環節和機制的闡明并不充分。基于以上研究背景，本研究在大鼠糖尿病腎病模型中，對3種不同工藝制備的芪葵顆粒的藥效和關鍵指標進行了評價，觀察其對糖尿病腎病大鼠血糖、尿蛋白排泄率、肌酐清除率以及腎臟病理組織學的影響，以期尋找芪葵顆粒改善糖尿病腎病的關鍵環節，并為臨床應用提供更為充分的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料

清潔級SD大鼠，雄性，8周齡，體重200～220 g，由南通大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK-（蘇）2014-0001。全價營養顆粒飼料（批號20150330）、高糖高脂飼料（配方：基礎飼料∶蛋黃∶豬油∶膽酸鈉∶蔗糖=63.5∶10∶8∶0.5∶18，批號：20150330）均由江蘇省協同醫藥生物技術有限公司提供。室溫（20±2）℃，濕度55%～65%，光照適度，通風潔凈良好。

1.2 儀器與試藥

血糖儀（Bayer HeaithCare LLC，型號1455）；拜安捷血糖試紙（Bayer HeaithCare LLCFA1004）；電子分析天平（上海精科天平廠）；全自動生化儀（Beckman Coulter Au480）。

芪葵顆粒（由我院制劑部提供，批號150 318）；鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma，批號078K1577V）；檸檬酸（QCBio，批號5949291）；檸檬酸鈉（QCBio，批號6132043）。

腦脊液與尿蛋白測定試劑盒（浙江康特生物科技有限公司，批號B150312）；葡萄糖測定試劑盒（浙江康特生物科技有限公司，批號A150408）；肌酐測定試劑盒（浙江康特生物科技有限公司，批號A150214）；尿素氮測定試劑盒（浙江康特生物科技有限公司，批號A150317）。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病腎病大鼠模型的建立 雄性健康SD大鼠54只，適應性飼養1周后，實驗前用代謝籠收集大鼠尿液測定尿糖，尿蛋白定性為陰性后開始手術。術前禁食12 h后，用10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪去腹部手術部位的毛，皮膚消毒后于劍突下1.5 cm沿腹中線切開皮膚及肌肉層，右手指深入腹腔摸著腎臟，左手指從腹部外側配合將腎臟輕輕擠出，用浸有生理鹽水的紗布包住，將其固定。于左腎近腎門處小心分離左腎動脈后，穿線打結，縫合腹部切口，碘酒消毒。術后1周后造模組給予高糖高脂飲食，空白組術前禁食12 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，皮膚消毒后于劍突下1.5 cm沿腹中線切開皮膚及肌肉層，不做處理，縫合腹部切口，正常飲食[5-7]。2周后造模組按40 mg/kg體重腹腔注射2%STZ（鏈脲佐菌素）。空白組（假手術組）腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。實驗期間動物自由進食、飲水。

1.3.2 動物分組與給藥 STZ造模72 h后大鼠尾尖部采血測定血糖，以血糖值11.4 mmol/L以上者為合格動物。按照血糖分為空白組（8只）、模型組（14只）、給藥組[厄貝沙坦組（0.04 g/kg），芪葵顆粒工藝1組（以下簡稱“工藝1組”），芪葵顆粒工藝2組（以下簡稱“工藝2組”），芪葵顆粒工藝3組（以下簡稱“工藝3組”），各組相當于18.67 g/kg，每組10只]。給藥組分別灌胃給予同體積不同濃度藥物10 mL/kg，空白組和模型組給予同體積生理鹽水，每日1次，10 mL/kg，連續5周。給藥過程中每周稱重，測定大鼠進食量、飲水量及尿量。

1.4 觀察指標

①尿蛋白及尿肌酐測定：分別于實驗末收集各組大鼠24 h尿液，測定尿蛋白及尿肌酐含量。②血清檢測：各組大鼠取血，檢測血糖含量，離心所得血清標本采用全自動生化分析儀檢測血尿素氮、血肌酐水平。③HE染色進行病理組織學檢查。

1.5 統計學方法

本研究采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病大鼠體重的影響

與空白組比較，模型組大鼠體重顯著降低（P < 0.01）。給藥后，與模型組比較，厄貝沙坦組、工藝1組、工藝2組及工藝3組大鼠體重均有不同程度的增加（P < 0.01或P < 0.05）。工藝1組、工藝2組及工藝3組大鼠體重與厄貝沙坦組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病大鼠進食量的影響

與空白組比較，模型組給藥1、2周后進食量明顯增加（P < 0.05）。與模型組比較，各給藥組給藥第2周以及工藝1、2、3組給藥4周大鼠進食量均顯著減少，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。工藝1組、工藝2組及工藝3組大鼠進食量與厄貝沙坦組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。endprint

2.3 不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病大鼠飲水量的影響

與空白組比較，模型組大鼠給藥前及給藥1、2、3周飲水量明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。與模型組比較，工藝2組和工藝3組大鼠給藥后第4、5周飲水量均顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。工藝1組、工藝2組及工藝3組大鼠飲水量與厄貝沙坦組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

2.4 不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病大鼠尿量的影響

與空白組比較，模型組大鼠給藥后尿量均明顯增多，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。與模型組比較，各給藥組尿量給藥第2周開始均明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。工藝1組、工藝2組及工藝3組大鼠尿量與厄貝沙坦組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表4。

2.5 不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病大鼠血糖的影響

與空白組比較，模型組大鼠血糖持續升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與模型組比較，厄貝沙坦組以及工藝2、3組給藥4周后血糖明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05）。工藝1組、工藝2組及工藝3組大鼠血糖與厄貝沙坦組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表5。

2.6 不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病大鼠血肌酐、血尿素氮和內生肌酐清除率的影響

給藥4周后，與空白組比較，模型組大鼠血肌酐、血尿素氮明顯升高，內生肌酐清除率顯著降低，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。與模型組比較，厄貝沙坦組和工藝3組血肌酐明顯降低（P < 0.05或P < 0.01），各給藥組血尿素氮明顯降低，內生肌酐清除率明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。與厄貝沙坦組比較，工藝2組大鼠的血肌酐以及工藝3組大鼠的內生肌酐清除率均明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表6。

2.7 不同工藝芪葵顆粒對糖尿病腎病大鼠尿蛋白與尿蛋白排泄率的影響

給藥4周后，與空白組比較，模型組大鼠尿蛋白排泄率明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。與模型組比較，厄貝沙坦組以及工藝2、3組尿蛋白排泄率明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05）。與厄貝沙坦組比較，工藝2組大鼠尿蛋白和尿蛋白排泄率均顯著升高，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。見表7。

2.8 病理組織學結果

空白組：腎小球無病變，腎小管上皮無變性壞死，腎小管無擴張，間質無炎細胞浸潤，無纖維結締組織增生。模型組：多數腎小球輕至中度肥大，部分腎小管擴張，腎小管上皮細胞空泡樣變性，間質血管擴張充血，可見炎細胞灶狀浸潤，腎盂黏膜下亦可見部分炎細胞浸潤。個別動物腎小管管腔內可見蛋白管型及細菌菌落散在分布。與模型組比較，不同工藝芪葵顆粒腎臟病變范圍和程度略有減輕，以厄貝沙坦組和工藝2組腎小球和腎小管病變減輕略為明顯（圖1）。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病嚴重而常見的并發癥，直接威脅糖尿病患者的預后[8-10]。現代醫學研究認為，糖尿病腎病的發病機制主要與長期持續高血糖導致的腎臟血流動力學改變、脂代謝紊亂、氧化應激、細胞因子和生長因子釋放、遺傳因素等有關，但其確切的發病機制仍未闡明[11-13]。

糖尿病腎病屬于中醫“消渴腎病”范疇，多數學者認為消渴并發“水腫”“水病”和“尿濁”等與糖尿病腎病相近，《圣濟總錄》記載“消腎，小便白濁如凝脂，形體羸弱”，明確指出消渴腎病時會出現蛋白尿[14]。消渴腎病是在糖尿病以陰虛為本、氣陰兩虛為基本證型的基礎上進一步演變而來，并認為“氣陰兩虛”是消渴腎病的重要病機[15]。近年來進一步認識到糖尿病腎病病機有以下特點：氣陰兩虛是糖尿病腎病早期的基本病機；濕熱是糖尿病腎病進展的重要因素；瘀血既是糖尿病腎病的病理產物，也是糖尿病腎病進展的關鍵因素。我院內分泌科余江毅主任參照國內外對糖尿病腎病的研究成果及多年臨床經驗，認為“氣陰兩虛、濕瘀阻絡”是糖尿病腎病的基本病機，提出“利濕瀉濁，化瘀通絡”的治療原則，對糖尿病腎病陰虛絡瘀證患者蛋白尿水平的降低有較好的療效，能顯著改善糖尿病腎病患者的臨床進程。

糖尿病腎病的臨床診斷依據蛋白尿的出現。糖尿病腎病早期改變主要為腎小球濾過率增高、腎小球肥大、腎小球毛細血管基底膜增厚、系膜區擴張[16-17]。本研究采用的工藝為：工藝1組為處方中黃芪、酒萸肉等所有藥味全部水提，減壓濃縮，一步法工藝制粒。工藝2組為黃芪、酒萸肉等水提，濾過，濃縮至適量；黃蜀葵花等醇提，回收乙醇后與水提濃縮液混合，一步法工藝制粒。工藝3組為黃芪、酒萸肉等水提，醇沉；黃蜀葵花等醇提，濾過，濾液與黃芪、酒萸肉水提醇沉上清液合并，回收乙醇，繼續濃縮后，一步法工藝制粒。

本研究結果顯示，給予不同工藝芪葵顆粒可改善糖尿病腎病大鼠多尿、體毛干枯無光澤、精神萎靡、活動減少等癥狀，可顯著降低糖尿病腎病大鼠血糖、尿素氮、肌酐和尿蛋白含量、尿蛋白排泄率。腎臟病理組織學結果也顯示模型組多數腎小球輕至中度肥大，腎小管擴張及上皮細胞空泡樣變性，間質血管擴張充血，炎細胞灶狀浸潤，個別動物腎小管管腔內可見蛋白管型及細菌菌落散在分布。與模型組比較，不同工藝芪葵顆粒可使腎臟病變范圍和程度略有減輕，以工藝2組腎小球和腎小管病變減輕略為明顯。通過以上不同工藝的比較和工藝制備流程適應批量生產確定為工藝2組為芪葵顆粒的最終工藝。

本研究采用單側腎結扎+高糖高脂+STZ注射制備糖尿病腎病模型。因單側腎結扎后加重對側腎臟負荷，導致對側腎臟代償性肥大，而腎臟肥大是糖尿病腎病的一個獨立危險因素，予高糖高脂飲食+STZ注射造成糖尿病模型，加速糖尿病腎病的形成，與臨床上糖尿病腎病患者表現為持續蛋白尿和進行性腎功能損害基本相似[18-20]。用此法造模，所需時間短，可以作為研究糖尿病腎病的理想工具，但操作復雜且動物死亡率高，所以在實驗設計時建議增加動物數量。endprint

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（收稿日期：2017-04-02 本文編輯：張瑜杰）endprint