嬰幼兒食品乳品和 中游離生物素測定方法的優化

胡國華

1.引言

生物素又稱為維生素H，屬于B族維生素，是含硫的一種維生素。生物素是乳制品重要的營養物質之一，這種維生素參與機體的三大營養代謝，是生物體生長發育必需的一種營養素，它參與有機體多種主要的新陳代謝活動。特別是對嬰幼兒及孕產婦有著特殊的重要性，因此在嬰幼兒乳制品、孕產婦乳制品及食品營養強化劑中添加生物素是十分必要的。主要的性能與用途有：構成視沉細胞內感光物質、維持上皮組織結構的完整和健全、增強機體免疫反應和抵抗力和維持正常生長發育。

近年來，生物素的發展越來越受到關注，檢測的方法也比較多，但每種檢測方法的原理、時效、以及針對的產品都各不相同，故在實際應用上，能針對樣品的不同而選擇合適的生物素檢測方法也是至關重要的。常用的生物素檢測方法有很多，主要包括微生物法、高效液相色譜法、酶聯免疫法、熒光法等。其中微生物的方法是目前應用比較廣泛的方法，也是嬰幼兒食品和乳品中游離生物素國標檢測方法中唯一的檢測方法，這個方法主要用于檢測樣品中生物素含量較低的情況。

此方法靈敏度高，但測試步驟繁瑣，工作量大，在用分光光度計讀數時要求漩渦混合后立即移入比色皿內進行讀數，并且要求每支試管的穩定時間相同，對操作者的熟練程度有較高的要求，一次最多能檢測1到3個培養管，檢測效率低，也會增加誤差，費時費力，因此需要開發一種更簡便和實用的檢測方法。

2.原理

利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對游離生物素的特異性和靈敏性，定量測定出試樣中待測物質的含量。在含有除待測物質以外所有營養成分的

培養基中，微生物的生長與待測物質含量呈線性關系，根據透光率與標準工作曲線進行比較，即可計算出試樣中待測物質的含量。

3.材料與方法

3.1 材料

3.1.1 菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），ATCC 8014。

3.1.2 生物素（d-Biotin 或Vitamin H）標準品（C10H16N2O3S）：純度≥99 %。

3.1.3 培養基：乳酸桿菌瓊脂培養基；乳酸桿菌肉湯培養基；生物素測定用培養基。

3.1.4 乙醇溶液（50 %）。

3.1.5 硫酸溶液（3 %）：量取3mL 硫酸加入到水中，定容至100 mL。

3.1.6 氫氧化鈉溶液（2 mol/L）：稱取80 g 氫氧化鈉溶于1000 mL 水中。

3.1.7 氯化鈉溶液（9 g/L）：稱取9.0 g 氯化鈉溶解于1000 mL 水中，分裝試管，每管10 mL。121℃滅菌15 min。

3.1.8 標準溶液的制備

3.1.8.1 生物素標準貯備液（100 μg/mL）：稱取生物素標準品（3.1.2）用乙醇溶液（3.1.4）定容至生物素

濃度為100 μg/mL，貯于冰箱中。

3.1.8.2 生物素標準中間液（1 μg/mL）：吸取1 mL 生物素標準貯備液（3.1.8.1），用乙醇溶液（3.1.4）定容至100 mL。

3.1.8.3 生物素標準工作液（10 ng/mL）：吸取1 mL 生物素標準中間液（3.1.8.2），用乙醇溶液（3.1.4）定容至100 mL。

3.1.8.4 標準曲線工作液：分兩個濃度，高濃度溶液的濃度為0.2 ng/mL；低濃度溶液的濃度為0. 1 ng/mL。從工作液中（3.1.8.3）吸取兩次各5 mL，用水分別定容到250 mL 和500 mL。

3.2 儀器和設備。

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

3.2.1 天平：感量為0.1 mg。

3.2.2 pH計：精度≤0.02。

3.2.3 分光光度計。

3.2.4 渦旋混合器。

3.2.5 離心機：轉速≥2000 轉/分鐘。

3.2.6 恒溫培養箱：36 ℃ ±1 ℃。

3.2.7 冰箱：2 ℃～5 ℃。

3.2.8 無菌吸管：10 mL （具0.1 mL 刻度） 或微量移液器或吸頭。

3.2.9 瓶口分液器：0 mL～10 mL。

3.2.10 錐形瓶：200 mL。

3.2.11 容量瓶（A 類）：100 mL，250 mL，500 mL。

3.2.12 單刻度移液管（A 類）：容量5 mL。

3.2.13 漏斗：直徑90 mm。

3.2.14 定量濾紙：直徑90 mm。

3.2.15 試管：18mm×180 mm。

注：玻璃儀器使用前，用活性劑（月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可）對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進行清洗，清洗之后在200 ℃干熱2 h，以去除玻璃器皿中的殘留物對試驗的影響。

3.3 分析步驟。

3.3.1 接種菌懸液的制備

3.3.1.1 將凍干菌株（3.1.1）活化后，轉接到乳酸桿菌瓊脂培養基（3.1.3.1）中，36 ℃ ±1 ℃培養過夜。再轉接2～3 代來增強活力。然后再將其從固體培養上轉接到乳酸桿菌肉湯培養基（3.1.3.2）中培養。

3.3.1.2 將乳酸桿菌肉湯中的培養液以2000 轉/分鐘離心2 min～3 min，傾出上清液，加入10 mL 氯化鈉溶液（3.1.7），混勻，再離心2 min～3 min，如此清洗3 次～4 次，吸適量該菌懸液于10 mL 鹽水（3.1.7）中，待測。endprint

3.3.1.3 用分光光度計以氯化鈉溶液（3.1.7）做空白，于550 nm 波長下測菌懸液（3.3.1.2）的透光率，使其透光率在60 %～80 %之間。

3.3.2 樣品的處理

3.3.2.1 干粉樣品

稱取一定量樣品（精確至0.0001 g）于250 mL 三角瓶中，該樣品應含0.2 μg～0.5 μg 生物素，繼續3.3.2.3 步驟。

3.3.2.2 液體樣品

吸一定量的液體樣品于250 mL 三角瓶中，該樣品應含0.2 μg～0.5 μg 生物素，繼續3.3.2.3 步驟。

3.3.2.3 樣品的提取

加入硫酸溶液（3.1.5）100 mL，121 ℃水解30 min，冷卻后用氫氧化鈉溶液（3.1.6）調節pH 至4.5±0.2，定量轉到250 mL 容量瓶中，用水定容，充分混合。用濾紙過濾，棄去最初的幾毫升。吸取濾液5 mL，加入約20 mL 水，用氫氧化鈉溶液（3.1.6）調pH 為6.8±0.2，定量轉到100 mL 容量瓶中，用水定容。

3.3.3 標準曲線的制作

按表1 順序加入水、標準曲線工作液（3.1.8.4）和生物素測定用培養基（3.1.3.3）于培養管中，一式三份。

3.3.4 待測液的制作

按表2 順序加水、樣品溶液（3.3.2.3）和生物素測定用培養基（3.1.3.3）于培養管內，一式三份。每份樣品需帶樣品空白試管一只，管內分別加入5 mL待測液和5 mL培養基。

3.3.5 滅菌

將3.3.3和3.3.4中所有的試管蓋上試管帽，放入高壓滅菌鍋內，121 ℃滅菌5 min（商品培養基按標簽說明進行滅菌）。

3.3.6 接種

從高壓滅菌鍋內取出試管，將試管迅速冷卻至30 ℃以下。將接種菌懸液（3.3.1.2）用滴管或移液器向上述試管中各滴加一滴（約50 μL），其中標準曲線管中未接種空白S1和樣品空白除外。

3.3.7 培養

將試管放入培養箱內，36 ℃ ±1 ℃培養19 h～20 h。

3.3.8 測定

對每支試管進行視覺檢查，接種空白試管S1 內培養液應是澄清的，如果出現渾濁，則結果無效。

3.3.8.1 以接種空白試管S1 做對照，測定最高濃度標準曲線試管的吸光度，兩小時后重新測定。兩次結果透光率差值若小于2 %，則取出全部檢驗管測其吸光度A。

3.3.8.2 以接種空白試管S2 為空白，調節吸光度為0，依次讀出其他每支試管的吸光度A，樣品空白的吸光度A 一并讀出。

3.3.8.3 用渦旋混合器充分混合每一支試管后，立即用兩種方法（即分光光度計法和酶標儀法）對各管中的培養液進行吸光度的測量。以生物素標準品的含量為橫坐標，吸光度A 為縱坐標作標準曲線。

3.3.8.4 對每個編號的待測液試管，用每支試管的吸光度值計算每毫升該編號待測液生物素的含量，并計算該編號待測液的生物素含量平均值，每支試管測得的該濃度不得超過該平均值的±15%，超過者要舍去。如果符合該要求的管數少于所有四個編號待測液總管數的2/3，需要重新檢驗。如果符合該要求的管數大于等于原來管數的2/3，重新計算每一編號的有效試樣管中每毫升測定液生物素含量的平均值，以此平均值計算全部編號試樣管的總平均值Cx，用于計算試樣中的生物素含量。

3.3.9 分析結果的表述

試樣中生物素的含量按公式 （1） 計算：

（1）

式中：

X——試樣中生物素的含量，單位為μg/100 g；

Cx——3.3.8.4中計算所得的總平均值，單位為ng；

m——試樣的質量，單位為克g；

f ——稀釋倍數。

以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留兩位有效數字。

3.3.10 精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10 %。

3.3.11 其他

本標準檢出限為20.0 μg/kg。

4.對比結果

5 .結論

隨著市場是嬰幼兒配方食品和乳品的增多，而生物素又是其中一種必要的添加物，也是國家標準中要求的項目，《GB5413.19-2010食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定》方法用分光光度計進行培養液的測量工作量大，且對操作者的熟練程度有較高的要求，一次最多能檢測3個培養管，檢測效率低，同時也增加誤差。而用酶標儀配合96孔板對培養液進行吸光度的測量時，能將所有試管中的液體放在同一塊96孔板中同時進行讀數，大大的減少了操作的時間，測試的結果與用分光光度計比較，誤差為0.1%。因此，在嬰幼兒食品和乳品中的游離生物素測試過程中，用酶標儀取代分光光度計對培養液進行吸光度的測量，可大大的降低人員的工作量，對優化后的檢驗方法更簡便，易于操作，且結果準確可靠，尤其適用于大批量樣品中游離生物素的測定。endprint