喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4表達(dá)變化及其意義

王亞莉，葛建榮

(1青海省人民醫(yī)院，西寧810000；2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

·臨床研究·

喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4表達(dá)變化及其意義

王亞莉1，葛建榮2

(1青海省人民醫(yī)院，西寧810000；2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

目的探討染色質(zhì)區(qū)解旋酶DNA結(jié)合蛋白5(CHD5)、E- 鈣黏蛋白(E- cadherin)、Smad家族成員4(Smad4)在喉鱗癌組織中的表達(dá)變化及其意義。方法選擇喉鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織各35例份，采用免疫組化SP法檢測兩種組織CHD5、E- cadherin、Smad4表達(dá)。比較兩種組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)，分析喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)的關(guān)系及其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)率均低于癌旁正常組織(P均<0.05)。相關(guān)分析顯示，喉鱗癌組織CHD5陽性表達(dá)與Smad4陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.810，P<0.05)，與E- cadherin陽性表達(dá)無相關(guān)性(r=-0.263，P>0.05)，E- cadherin陽性表達(dá)與Smad4陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.481，P<0.05)。喉鱗癌組織CHD5陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，E- cadherin陽性表達(dá)與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Smad4陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)者術(shù)后生存時間>3年比例明顯高于其陰性表達(dá)者(P均<0.05)。結(jié)論喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4低表達(dá)，其表達(dá)變化與喉鱗癌的惡性生物學(xué)行為和患者預(yù)后有關(guān)。

喉鱗狀細(xì)胞癌；染色質(zhì)區(qū)解旋酶DNA結(jié)合蛋白5；E- 鈣黏蛋白；Smad家族成員4

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤率的3%，其組織學(xué)類型以鱗癌最常見[1]。喉鱗癌具有易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，是影響患者預(yù)后的重要因素[2]。目前認(rèn)為，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是多因素共同作用的結(jié)果。有研究證實(shí)，染色質(zhì)區(qū)解旋酶DNA結(jié)合蛋白5(CHD5)基因缺失與多種腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肺癌等[3～7]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生等生理過程中具有重要作用。E- 鈣黏蛋白(E- cadherin)、Smad家族成員4(Smad4)等是EMT重要的分子生物學(xué)標(biāo)記物。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織中可見E- cadherin、Smad4表達(dá)改變，表明EMT可參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。2012年3月～2015年9月，本研究觀察了喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4表達(dá)變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 基本資料 選擇同期青海省人民醫(yī)院和蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的喉鱗癌患者35例。所有患者術(shù)前未行任何抗腫瘤治療，術(shù)后經(jīng)組織病理檢查明確診斷。排除合并心、肝、腎等重要臟器疾病，免疫系統(tǒng)疾病，感染性疾病以及嚴(yán)重的心腦血管疾病。其中，男18例、女17例，年齡(58.21±12.37)歲；組織分化程度：高分化21例，中低分化14例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期23例，Ⅲ、Ⅳ期12例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例。本研究經(jīng)青海省人民醫(yī)院和蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。結(jié)果分析采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 喉鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織CHD5、E- cadherin、Smad4表達(dá) 取手術(shù)切除的喉鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣≥1 cm)，4%中性甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育，微波抗原修復(fù)；加入正常山羊血清室溫封閉20 min，棄去血清，分別滴加CHD5、E- cadherin和Smad4一抗工作液(稀釋倍數(shù)1∶150)，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌5 min×3次，加入生物素標(biāo)記的二抗(稀釋倍數(shù)1∶200)，室溫孵育30 min；PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。以PBS替代一抗作陰性對照。判定標(biāo)準(zhǔn)：CHD5陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，E- cadherin陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，Smad4陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)。隨機(jī)選取10個含有陽性細(xì)胞的400倍視野進(jìn)行觀察。陽性細(xì)胞所占比例：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞所占比例≤25%為1分，陽性細(xì)胞所占比例>25%～50%為2分，陽性細(xì)胞所占比例>50%為3分；染色程度：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分。按陽性細(xì)胞所占比例和染色程度綜合判定[9]，二者之和>3分為陽性表達(dá)、≤3分為陰性表達(dá)。結(jié)果顯示，喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)率分別為42.86%(15/35)、45.71%(16/35)、40.00%(14/35)，癌旁正常組織分別為97.14%(34/35)、91.42%(32/35)、94.29%(33/35)。喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)率均低于癌旁正常組織(P均<0.05)。

1.3 喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)的關(guān)系 15例CHD5陽性表達(dá)者中E- cadherin均為陰性表達(dá)，Smad4陽性表達(dá)1例、陰性表達(dá)14例；Spearman等級相關(guān)分析顯示，喉鱗癌組織CHD5陽性表達(dá)與Smad4陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.810，P<0.05)，與E- cadherin陽性表達(dá)無相關(guān)性(r=-0.263，P>0.05)。16例E- cadherin陽性表達(dá)者中，Smad4陽性表達(dá)3例、陰性表達(dá)13例；Spearman等級相關(guān)分析顯示，喉鱗癌組織E- cadherin陽性表達(dá)與Smad4陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.481，P<0.05)。

1.4 喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

1.5 喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 所有患者術(shù)后隨訪1～36個月，記錄術(shù)后生存時間。其中，術(shù)后生存時間>3年19例、≤3年16例。15例CHD5陽性表達(dá)者中，術(shù)后生存時間>3年11例(73.33%)；20例CHD5陰性表達(dá)者中，術(shù)后生存時間>3年5例(25.00%)。16例E- cadherin陽性表達(dá)者中，術(shù)后生存時間>3年12例(75.00%)；19例E- cadherin陰性表達(dá)者中，術(shù)后生存時間>3年4例(21.05%)。14例Smad4陽性表達(dá)者中，術(shù)后生存時間>3年11例(78.57%)；21例Smad4陰性表達(dá)者中，術(shù)后生存時間>3年5例(23.81%)。CHD5、E- cadherin、Smad4陽性表達(dá)者術(shù)后生存時間>3年比例均明顯高于其陰性表達(dá)者(P均<0.05)。

2 討論

目前認(rèn)為，侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致喉鱗癌患者預(yù)后不良的主要原因，故早期發(fā)現(xiàn)其侵襲和轉(zhuǎn)移的證據(jù)具有重要意義。但臨床上缺少判定喉鱗癌早期發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)標(biāo)記物[10]。

CHD5屬于ATP依賴染色質(zhì)重塑酶，能夠通過水解ATP提供能量，改變?nèi)旧|(zhì)中核小體的位置，從而改變組蛋白與DNA鏈之間的空間構(gòu)象，調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄活性[11]。研究發(fā)現(xiàn)，CHD5在霍奇金淋巴瘤、皮肌炎等多種疾病以及超過50%的腫瘤中異常表達(dá)[12]。本研究結(jié)果顯示，喉鱗癌組織CHD5陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，其陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，且其陽性表達(dá)者術(shù)后生存時間>3年比例明顯高于陰性表達(dá)者，與Wang等[13]研究結(jié)果一致。說明CHD5在喉鱗癌的發(fā)生過程中可能具有抑癌基因作用。

EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，涉及到多種蛋白分子，如鈣連接素。E- cadherin是鈣連接素中影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的一種重要蛋白，在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，并與腫瘤的去分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后不良有關(guān)[14]。研究證實(shí)，E- cadherin在喉鱗癌細(xì)胞黏附紊亂中發(fā)揮重要作用，但其與喉鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系仍存在爭議。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喉鱗癌組織E- cadherin陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，其陽性表達(dá)與腫瘤組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且其陽性表達(dá)者術(shù)后生存時間>3年比例明顯高于陰性表達(dá)者。提示E- cadherin參與了喉鱗癌細(xì)胞的EMT過程，其陽性表達(dá)升高可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF- β)是已知誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的重要因子，而Smad4是TGF- β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個關(guān)鍵性因子[15]。已有研究證實(shí)，Smad4缺失可促進(jìn)原癌基因活化，使腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[16～18]。Papageorgis等[19]研究認(rèn)為，Smad4具有抑癌基因功能，其表達(dá)缺失是多種腫瘤患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素。本研究結(jié)果顯示，喉鱗癌組織Smad4陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，其陽性表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，且其陽性表達(dá)者術(shù)后生存時間>3年比例明顯高于陰性表達(dá)者。表明Smad4表達(dá)變化有助于判斷喉鱗癌的疾病進(jìn)程及評估患者預(yù)后。

CHD5參與組成CHD5/MTA3/NuRD復(fù)合物，該復(fù)合物能夠與Snail(E- cadherin的上游負(fù)性調(diào)控基因)競爭性結(jié)合至E- cadherin啟動子區(qū)，從而促進(jìn)E- cadherin基因的轉(zhuǎn)錄[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHD5與Smad4、E- cadherin與Smad4均呈正相關(guān)關(guān)系，三者均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；在喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中CHD5與Smad4、E- cadherin與Smad4可能發(fā)揮協(xié)同作用。本研究并未發(fā)現(xiàn)CHD5與E- cadherin存在相關(guān)性，可能與研究病例數(shù)較少有關(guān)。

綜上所述，喉鱗癌組織CHD5、E- cadherin、Smad4低表達(dá)，其表達(dá)變化與喉鱗癌的惡性生物學(xué)行為和患者預(yù)后有關(guān)。CHD5、E- cadherin、Smad4有可能作為評價喉鱗癌惡性生物學(xué)行為的潛在指標(biāo)，并可為其治療提供有價值的靶標(biāo)。

[1] Marur S, Forastiere AA. Head and neck squamous cell carcinoma: update on epidemiology, diagnosis, and treatment[J]. Mayo Clin Proc, 2016,91(3):386- 396.

[2] Taguchi T, Nishimura G, Takahashi M, et al. Treatment results and prognostic factors for advanced squamous cell carcinoma of the head and neck treated with salvage surgery after concurrent chemoradiotherapy[J]. Int J Clin Oncol, 2016,21(5):869- 874.

[3] Xie CR, Li Z, Sun HG, et al. Mutual regulation between CHD5 and EZH2 in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2015,6(38):40940- 40952.

[4] Wu X, Zhu Z, Li W, et al. Chromodomain helicase DNA binding protein 5 plays a tumor suppressor role in human breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2012,14(3):R73.

[5] Lang J, Tobias ES, Mackie R. Preliminary evidence for involvement of the tumour suppressor gene CHD5 in a family with cutaneous melanoma[J]. Br J Dermatol, 2011,164(5):1010- 1016.

[6] Wong RR, Chan LK, Tsang TP, et al. CHD5 downregulation associated with poor prognosis in epithelial ovarian cancer[J]. Gynecol Obstet Invest, 2011,72(3):203- 207.

[7] Zhao R, Yan Q, Lv J, et al. CHD5, a tumor suppressor that is epigenetically silenced in lung cancer[J]. Lung Cancer, 2012,76(3):324- 331.

[8] Park JW, Park DM, Choi BK, et al. Establishment and characterization of metastatic gastric cancer cell lines from murine gastric adenocarcinoma lacking Smad4, p53, and E- cadherin[J]. Mol Carcinog, 2015,54(11):1521- 1527.

[9] Mathew J, Pathrose S, Kottoor J, et al. Evaluation of an indigenously prepared Herbal extract (EndoPam) as an antimicrobial endodontic irrigant: an ex vivo study[J]. J Int Oral Health, 2015,7(6):88- 91.

[10] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2017[J]. CA Cancer J Clin, 2017,67(1):7- 30.

[11] Zhou CY, Narlikar GJ. Analysis of nucleosome sliding by ATP- dependent chromatin remodeling enzymes[J]. Methods Enzymol, 2016(573):119- 135.

[12] Kolla V, Zhuang T, Higashi M, et al. Role of CHD5 in human cancers: 10 years later[J]. Cancer Res, 2014,74(3):652- 658.

[13] Wang J, Chen H, Fu S, et al. The involvement of CHD5 hypermethylation in laryngeal squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncol, 2011,47(7):601- 608.

[14] 魯海珍，劉尚梅.E- cadherin和COX- 2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].中國腫瘤臨床，2013，40(8)：458- 461.

[15] Massagué J. TGFβ signalling in context[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012,13(10):616- 630.

[16] Bornstein S, White R, Malkoski S, et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation[J]. J Clin Invest, 2009,119(11):3408- 3419.

[17] Xia X, Wu W, Huang C, et al. SMAD4 and its role in pancreatic cancer[J]. Tumour Biol, 2015,36(1):111- 119.

[18] Yang J, Wang Y, Zeng Z, et al. Smad4 deletion in blood vessel endothelial cells promotes ovarian cancer metastasis[J]. Int J Oncol, 2017,50(5):1693- 1700.

[19] Papageorgis P, Cheng K, Ozturk S, et al. Smad4 inactivation promotes malignancy and drug resistance of colon cancer[J]. Cancer Res, 2011,71(3):998- 1008.

[20] Kolla V, Naraparaju K, Zhuang T, et al. The tumour suppressor CHD5 forms a NuRD- type chromatin remodelling complex[J]. Biochem J, 2015,468(2):345- 352.

青海省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2016- K- 9P4)。

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.015

R739.65

B

1002- 266X(2017)36- 0049- 03

2017- 05- 03)