肝癌組織miR- 148a表達變化及其與患者臨床病理參數和術后早期復發的關系

周興芹，陳鐘，常仁安

(南通大學附屬醫院,江蘇南通226001)

肝癌組織miR- 148a表達變化及其與患者臨床病理參數和術后早期復發的關系

周興芹，陳鐘，常仁安

(南通大學附屬醫院,江蘇南通226001)

目的觀察原發性肝癌(HCC)組織微小RNA- 148a(miR- 148a) mRNA表達變化，并分析其與患者臨床病理參數和術后早期復發的關系。方法選擇HCC組織及其配對的癌旁正常組織各142例份，采用qRT- PCR法檢測miR- 148a mRNA表達。分析HCC組織miR- 148a mRNA表達與患者臨床病理參數及術后早期復發的關系。結果HCC組織miR- 148a mRNA相對表達量明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)。以142例HCC患者miR- 148a mRNA相對表達量的均數為截斷值，將患者分為miR- 148a mRNA高表達者65例和miR- 148a mRNA低表達者77例。miR- 148a mRNA表達與腫瘤大小、微血管侵犯及TNM分期有關(P均<0.05)，而與年齡、性別、肝硬化、血清AFP水平、HBV感染、組織分化程度及腫瘤數目無關(P均>0.05)。142例HCC患者中，早期復發88例、未復發54例。早期復發者miR- 148a mRNA相對表達量明顯低于未復發者(P<0.05)。88例早期復發者中，miR- 148a mRNA低表達者55例、miR- 148a mRNA高表達者33例，miR- 148a mRNA低表達者早期復發率明顯高于miR- 148a mRNA高表達者(P<0.05)。采用受試者工作特征(ROC)曲線評價miR- 148a mRNA預測HCC術后早期復發的價值，結果顯示，miR- 148a mRNA預測HCC術后早期復發的ROC曲線下面積為0.710(95%CI：0.660～0.769，P<0.01)，其cut off值為0.31，此時miR- 148a mRNA預測HCC術后早期復發的敏感性、特異性分別77.1%、71.8%。結論HCC組織中miR- 148a mRNA低表達，其表達變化與腫瘤進展有關。miR- 148a mRNA可作為HCC患者術后早期復發的預測因子之一。

原發性肝癌；微小RNA- 148a；臨床病理參數；復發

全球范圍內每年因肝癌死亡的患者約70萬，其中我國約占50%[1]。目前，原發性肝癌(HCC)的治療方法有多種。手術治療仍是HCC的首選治療方法，但術后易復發，術后2年內復發率為62.4%～77.8%，5年生存率較低[2～5]。因此，探討HCC術后早期復發的分子機制，尋找準確預測HCC術后早期復發的腫瘤分子生物學標志物意義重大。微小RNA(miRNA)是一類由19～25個核苷酸組成的、高度保守的內源性非編碼小分子RNA，可通過與目標基因mRNA的3′非翻譯區結合，調控下游靶基因表達，繼而發揮相應的生物學功能[6,7]。近年研究發現，miRNA與腫瘤的發生、發展密切相關[8,9]。miR- 148a是miRNA家族的成員之一，研究發現，其在胃癌、結腸癌及非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤組織中低表達，具有抑癌基因作用[10～12]。但目前關于miR- 148a mRNA在HCC組織中表達的報道甚少，且其與患者臨床病理參數及術后早期復發的關系尚不完全明確。2011年1月～2014年7月，本研究觀察了HCC組織中miR- 148a mRNA表達變化，現分析其與患者臨床病理參數及術后早期復發的關系。

1 臨床資料

1.2 HCC組織及其配對癌旁正常組織miR- 148a mRNA表達比較 將手術切除的HCC組織及其配對的癌旁正常組織(距癌組織邊緣≥2 cm)離體30 min內置于液氮中，再轉入- 80 ℃低溫冰箱中凍存。取部分HCC組織及癌旁正常組織，采用TRIzol法提取組織總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA純度，OD260/OD280為1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整，符合實驗要求。取總RNA 1 μg，按RNA逆轉錄試劑盒說明逆轉錄為cDNA，然后按qRT- PCR試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：miR- 148a上游引物：5′- ACACTCCAGCTGGGACAAA-GTTCTG- 3′，下游引物： 5′- CTCAACTGGTGTCGTGG-AGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGTGCAC- 3′；內參U6上游引物：5′- CTCGCTTCGGCAGCACA- 3′，下游引物：5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3′。PCR反應體系共25 μL：SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2×)12.5 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，無酶水8.5 μL；反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s共40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR- 148a mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。結果顯示，HCC組織miR- 148a mRNA相對表達量為0.35±0.04，癌旁正常組織為1.00±0.02，二者比較P<0.05。以142例患者miR- 148a mRNA相對表達量的均數為截斷值，miR- 148a mRNA高表達者65例，miR- 148a mRNA低表達者77例。

1.2 miR- 148a mRNA表達與HCC患者臨床病理參數的關系 miR- 148a mRNA表達與腫瘤大小、微血管侵犯及TNM分期有關(P均<0.05)，與年齡、性別、肝硬化、血清AFP水平、HBV感染、組織分化程度及腫瘤數目無關(P均>0.05)。見表1。

表1 miR- 148a mRNA表達與HCC患者 臨床病理參數的關系[例(%)]

1.3 miR- 148a mRNA表達與HCC患者術后早期復發的關系 所有患者術后隨訪2年。術后1年內每2個月門診或住院復查1次，術后1～2年每2～3個月復查1次。復查AFP、胸部X線、腹部B超，必要時進行CT、MRI或PET- CT檢查。以術后2年內復發定義為早期復發。142例HCC患者中，早期復發88例、未復發54例。早期復發者和未復發者miR- 148a mRNA相對表達量分別為0.20±0.03、0.59±0.06，二者比較P<0.05。88例早期復發者中，miR- 148a mRNA低表達者55例、高表達者33例，miR- 148a低表達者早期復發率明顯高于miR- 148a高表達者(P<0.05)。

1.4 miR- 148a mRNA表達預測HCC術后早期復發的價值 ROC曲線分析顯示，miR- 148a mRNA表達預測HCC術后早期復發的曲線下面積為0.710(95%CI：0.660～0.769，P<0.01)，其cut off值為0.31，此時miR- 148a mRNA預測HCC術后早期復發的敏感性、特異性分別為77.1%、71.8%。見圖1。

2 討論

圖1 miR- 148a mRNA表達預測HCC患者術后早期復發的ROC曲線

目前關于HCC術后早期復發的分子生物學機制尚不完全明確，臨床上缺乏特異性強、敏感性高地預測HCC術后早期復發指標。Budhu等[13]研究發現，Th2- dominant細胞因子與HCC術后早期復發有關；Woo等[14]利用基因芯片技術篩選出了12種與HCC術后早期復發相關的分子生物學標志物，但其預測效果均不令人滿意。

miR- 148a是miR- 148a/152家族成員之一，定位于染色體7p15.2，其成熟體由22個核苷酸組成，含有一個包含8個核苷酸區域的種子序列。研究證實，miR- 148a在多種惡性腫瘤組織中表達下調，并可影響腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移等生物學行為[10～12]；其在胃癌組織中低表達，且在Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中的表達較Ⅰ、Ⅱ期明顯降低，提示miR- 148a mRNA低表達與胃癌的惡性進展有關[15]。Szafranska等[16]研究發現，miR- 148a mRNA在胰腺癌組織中表達下調，miR- 148a mRNA低表達可造成其靶基因DNMT1表達升高，從而增加DNMT1對抑癌基因的過度甲基化，繼而促進胰腺癌的惡性進展。Tsai等[17]研究發現，復發性結腸癌患者血清miR- 148a mRNA水平降低，并可作為結腸癌根治性切除術后早期復發的分子生物學標志物。

既往研究發現，miR- 148a mRNA在HCC組織中表達下調[18]，過表達miR- 148a mRNA能夠阻滯細胞周期，抑制HCC細胞增殖[19]。Heo等[20]研究發現，miR- 148a mRNA在HCC組織中表達下調，并與患者預后不良有關。本研究結果顯示，HCC組織中miR- 148a mRNA表達降低，且早期復發者miR- 148a mRNA表達較未復發者顯著降低，提示miR- 148a mRNA表達降低可能與HCC術后早期復發有關。本研究還發現，miR- 148a mRNA低表達與腫瘤大小、微血管侵犯、TNM分期及淋巴結轉移有關，而與年齡、性別、肝硬化、血清AFP水平、HBV感染、組織分化程度及腫瘤數目無關。提示miR- 148a mRNA低表達與HCC患者病情及惡性進展有關。

目前，關于HCC術后早期復發的判定尚無明確標準。有學者將HCC術后2年內復發定義為早期復發[21，22]，也有學者選擇1年[23]甚至6個月[24]作為術后早期復發的界線。本研究將術后2年內復發定義為早期復發，術后隨訪發現，142例HCC患者中早期復發88例，且miR- 148a mRNA低表達者早期復發率明顯高于miR- 148a mRNA高表達者。ROC曲線分析顯示，miR- 148a mRNA表達預測HCC術后早期復發的曲線下面積為0.710，其cut off值為0.31，此時miR- 148a mRNA預測HCC術后早期復發的敏感性、特異性分別為77.1%、71.8%，提示miR- 148a mRNA對預測HCC術后早期復發有一定臨床價值。

綜上所述，HCC組織中miR- 148a mRNA低表達，其表達變化與腫瘤進展有關；miR- 148a mRNA可作為HCC患者術后早期復發的預測因子之一。

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ExpressionchangesofmiR- 148ainhepaticcarcinomatissuesanditsrelationshipswithclinicopathologicalparametersandearlypost-operativerecurrence

ZHOUXingqin,CHENZhong,CHANGRen′an

(AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China)

To observe the expression changes of microRNA- 148a (miR- 148a) in the primary hepatic carcinoma (HCC) tissues, and further to analyze its relationships with the clinicopathological parameters of patients and their early post- operative recurrence.MethodsQuantitative RT- PCR (qRT- PCR) were used to detect the relative expression of miR- 148a in 142 cases of HCC tissues and 142 cases of paired adjacent normal tissues. The relationships between miR- 148a expression and the clinicopathological parameters as well as early post- operative recurrence in HCC patients were analyzed.ResultsThe relative expression of miR- 148a was significantly lower in HCC tissues than in the adjacent normal tissues (P<0.05). The mean of the relative expression of miR- 148a in HCC tissues from 142 patients was set as cut- off value, thereafter, patients were categorized into the high- expression group (n=65) and low- expression group (n=77). The expression of miR- 148a was significantly associated with tumor size, microvascular invasion, and TNM stages (P<0.05), while was not statistically associated with age, gender, cirrhosis, serum level of AFP, HBV infection, histological differentiation, or tumor numbers (P>0.05). In the 142 HCC patients, 88 of them suffered from early post- operative recurrence, while the other 54 patients did not. The expression of miR- 148a was significantly lower in patients with early post- operative recurrence than that of those without recurrence (P<0.05). In the 88 patients with early post- operative recurrence, there were 55 cases of patients with low expression of miR- 148a and 33 patients with high expression of miR- 148a. The early recurrence rate was significantly higher in patients with low expression of miR- 148a than that of those with high expression of miR- 148a (P<0.05). Receiver operating characteristic (ROC) curve was used to evaluate the predictive value of miR- 148a in early post- operative recurrence. Consequently, area under the curve was 0.710 (95%CI:0.660- 0.769,P<0.01), and the cut- off value of relative mRNA expression of miR- 148a was 0.31. Therefore, the sensitivity and specificity of miR- 148a expression in predicting early post- operative recurrence of HCC was 77.1% and 71.8%, respectively.ConclusionThe miR- 148a is low expressed in HCC tissues, and the expression change is associated with tumor progression. Moreover, miR- 148a can be taken as an effective predictive indicator for early post- operative recurrence of HCC.

primary hepatic carcinoma; micro RNA- 148a; clinicopathological parameters; recurrence

江蘇省臨床醫學科技專項基金資助項目(BL2014060)；江蘇省“科教興衛工程”醫學領軍人才和創新團隊基金資助項目(LJ201134)；南通市科技計劃項目(MS22016041)。

周興芹(1978- )，女，主治醫師，主要研究方向為惡性腫瘤的分子生物學機制。E- mail： zhouxingqin666@126.com

常仁安(1975- )，男，副主任醫師，主要研究方向為肝臟惡性腫瘤的診治。E- mail： xuluzlk@yeah.net

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.003

R735.7

A

1002- 266X(2017)36- 0009- 04

2017- 02- 21)