沉默HMGB1基因對非小細胞肺癌細胞上皮間質轉化的影響及作用機制

蒲江濤，唐小軍，宋琦，胡智，何開明，吳云飛，戴天陽

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

沉默HMGB1基因對非小細胞肺癌細胞上皮間質轉化的影響及作用機制

蒲江濤，唐小軍，宋琦，胡智，何開明，吳云飛，戴天陽

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

目的探討沉默高遷移率族蛋白1(HMGB1)基因對非小細胞肺癌細胞上皮間質轉化(EMT)的影響及其作用機制。方法取傳3代非小細胞肺癌A549細胞，隨機分為si- HMGB1組、陰性對照組、空白組。si- HMGB1組、陰性對照組分別轉染HMGB1 siRNA序列、陰性對照siRNA序列，空白組不予轉染。各組繼續孵育72 h，檢測HMGB1 mRNA表達。收集各組孵育72 h細胞，采用Western blotting法檢測EMT相關蛋白(E- cadherin、VDR、N- cadherin、Vimentin)和TGF- β/Smad信號通路相關蛋白(Snail、NF- κB p65、p- NF- κB p65)表達。結果si- HMGB1組HMGB1 mRNA相對表達量明顯低于陰性對照組和空白組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白組比較P>0.05。si- HMGB1組E- cadherin、VDR蛋白相對表達量明顯高于陰性對照組和空白組(P均<0.05)，N- cadherin、Vimentin蛋白相對表達量明顯低于陰性對照組和空白組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白組各EMT相關蛋白相對表達量比較P均>0.05。si- HMGB1組Snail、p- NF- κB p65蛋白相對表達量明顯低于陰性對照組和空白組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白組比較P均>0.05。三組間NF- κB p65蛋白相對表達量比較P均>0.05。結論沉默HMGB1基因能夠逆轉非小細胞肺癌細胞EMT，其機制可能與阻斷Snail/NF- κB信號通路有關。

非小細胞肺癌；高遷移率族蛋白1；上皮間質轉化；基因沉默

肺癌是我國發病率最高的惡性腫瘤之一，其中70%～80%為非小細胞肺癌。絕大多數非小細胞肺癌患者就診時已出現侵襲和轉移，喪失了最佳手術時機，5年生存率不超過15%[1]。上皮間質轉化(EMT)是調控腫瘤侵襲和轉移的始動因素之一，且與腫瘤細胞的放療抵抗和化療耐藥密切相關[2,3]。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種高度保守的核蛋白，在哺乳動物細胞中廣泛存在。有研究發現，HMGB1在肝癌、卵巢癌等細胞中高表達，并與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，其機制可能是通過HMGB1介導EMT而實現的[4]。但在肺癌細胞中HMGB1與EMT的關系及其可能的作用機制尚不清楚。2017年2～5月，本研究通過小干擾RNA(siRNA)技術沉默非小細胞肺癌A549細胞HMGB1基因，觀察其對EMT的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細胞肺癌細胞株A549，購自中國科學院上海細胞庫。HMGB1 siRNA片段由上海吉凱基因化學技術有限公司設計合成，靶序列：GGAGAACGCCCGTTATGAA，正義鏈：5′- GGACAAC-GCCGGUUAUGAA- 3′，反義鏈：3′- CCUGUUGCGGCC-AAUAGUU- 5′。陰性對照siRNA序列，美國Invitrogen公司。7500型實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；凝膠成像分析系統，美國Bio- Rad公司；垂直電泳槽，美國GE公司；連續光譜酶標儀，美國Molecular Devvices公司；DU800型紫外/可見光分光光度計，美國Beckman Coulter公司。RPMI 1640培養基，美國Gibco公司；TRIzol試劑、RT- PCR試劑盒、Lipofectamine 2000，美國Invitrogen公司；M- MLV逆轉錄酶、RNase抑制劑、dNTP，寶生物工程(大連)有限公司；RIPA裂解液、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、BCA蛋白濃度測定試劑盒，廣州碧云天生物技術研究所。Transwell小室、Matrigel人工基底膜，美國BD公司?？笻MGB1(1∶100)、抗NF- κB p65(1∶100)、p- NF- κB p65(1∶100)、抗GAPDH(1∶200)，武漢博士德生物工程有限公司；抗E- cadherin(1∶100)、抗VDR(1∶50)、抗N- cadherin(1∶100)、抗Vimentin(1∶200)，江蘇碧云天生物技術研究所；抗Snail(1∶100)，生工生物工程(上海)股份有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG二抗(1∶4 000)、聚丙烯酰胺、PVDF膜、十二烷基硫酸鈉，美國Sigma公司。

1.2 細胞培養 將非小細胞肺癌A549細胞接種于RPMI 1640培養基(含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中常規培養，每2～3天更換1次培養基，每3天傳代1次，取傳3代細胞用于后續實驗。

1.3 沉默HMGB1基因及效果驗證 取傳3代對數生長期細胞，0.125%胰蛋白酶消化，加入不含血清的PRMI 1640培養基重懸，使細胞懸液密度為1.5×105個/mL，然后接種于6孔板，每孔2×104個。隨機將細胞分為si- HMGB1組、陰性對照組、空白組。si- HMGB1組每孔加入Lipofectamine 2000 5 μL、HMGB1 siRNA干擾序列5 μL和不含血清的培養基500 μL；陰性對照組每孔中加入Lipofectamine 2000 5 μL、陰性對照siRNA 5 μL和不含血清的培養基500 μL；空白組僅加入不含血清的培養基500 μL。所有細胞在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育72 h。 采用RT- PCR法驗證HMGB1基因沉默效果。收集各組孵育72 h生長狀態良好細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測260、280 nm波長處的吸光度(A)值，A260/A280>2.0表示細胞總RNA純度合格。取總RNA 2 μL，按照逆轉錄試劑盒說明逆轉錄為cDNA，然后按SYBRPremix ExTaqⅡ試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：HMGB1上游引物：5′- ATGCCTGTAACAAAGAAGCCCC- 3′，下游引物：5′- CACACAGTTGCCCCCGTTTTTAC- 3′；GAPDH上游引物：5′- ATGTCGTGGAGTCTACTGGC- 3′，下游引物：5′- TGACCTTGCCCACAGCCTTG- 3′。PCR反應體系：ddH2O 8 μL，2×SYBR Green Ⅰ Master 10 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL；反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃延伸40 s，35個循環后，74 ℃延伸5 min。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。結果顯示，陰性對照組HMGB1 mRNA相對表達量為0.043±0.002、空白組為0.045±0.005、si- HMGB1組為0.007±0.001。si- HMGB1組HMGB1 mRNA相對表達量明顯低于陰性對照組和空白組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白組比較P>0.05。

1.4 EMT相關蛋白及TGF- β/Smad信號通路相關蛋白表達檢測

1.4.1 E- cadherin、VDR、N- cadherin、Vimentin蛋白表達 采用Western blotting法。取各組傳3代對數生長期細胞，RIPA裂解液充分裂解，4 ℃、2 500 r/min離心20 min，留取上清液。BCA法蛋白定量合格后，移至EP管中，加入等量上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，行SDS- PAGE，并轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入E- cadherin、VDR、N- cadherin、Vimentin抗體，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫振蕩孵育2 h；PBS沖洗3次，ECL顯色，凝膠成像分析系統采集圖像。以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與GAPDH蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4.2 Snail、NF- κB p65、p- NF- κB p65蛋白表達 采用Western blotting法。加入的一抗分別為Snail、NF- κB p65、p- NF- κB p65抗體，其余操作同1.4.1。

2 結果

2.1 各組E- cadherin、VDR、N- cadherin、Vimentin蛋白表達比較 見表1。

表1 各組E- cadherin、VDR、N- cadherin、Vimentin 蛋白相對表達量比較

注：與空白組比較，*P<0.01；與陰性對照組比較，#P<0.01。

2.2 各組Snail、NF- κB p65、p- NF- κB p65蛋白表達比較 見表2。

表2 各組Snail、NF- κB p65、p- NF- κB p65 蛋白相對表達量比較

注：與空白組比較，*P<0.01；與陰性對照組比較，#P<0.01。

3 討論

EMT是腫瘤上皮細胞獲得侵襲和遷移能力的主要機制。在EMT過程中，上皮細胞從原來的致密圓形變成細長梭形，在細長的胞體末端形成絲狀偽足，使細胞獲得運動能力[5]；細胞間的黏附力減弱，排列疏松，細胞逐漸從原部位脫離并侵襲至細胞間，繼而進入血液或淋巴循環，最終發生遠處轉移[6]。EMT的主要特征為上皮標志物(如E- cadherin、VDR)表達缺失，而間質標志物(如N- cadherin、Vimentin)表達增加。Avtanski等[7]研究發現，在EMT過程中，肺癌上皮細胞逐漸失去原來的極性，即從頂-底極性轉化為前-后極性，繼而使肺癌細胞的侵襲和遷移能力增強。

HMGB1是哺乳動物細胞中普遍存在的核蛋白。既往研究認為，HMGB1在細胞中發揮類似炎癥因子的作用，可介導激活免疫系統，引起局部或全身炎癥反應[8]。近年研究顯示，HMGB1可在TNF- α的刺激下誘導腫瘤細胞的侵襲和遷移等生物學行為[9]；侵襲期腫瘤細胞分泌的HMGB1能夠與特異性受體晚期糖基化蛋白(RAGE)結合，并激活基質金屬蛋白酶2(MMP- 2)和MMP- 9，導致纖維蛋白溶酶發生級聯反應，使細胞外基質發生降解，最終誘導腫瘤細胞侵襲和遷移[10]；HMGB1/RAGE復合物激活后能夠調節肝癌細胞的增殖和侵襲，而抑制HMGB1則可抑制肝癌細胞生長，提示HMGB1或與肝癌的發生和轉移有關[11]。HMGB1能夠調控上皮標志物E- cadherin和間質標志物Vimentin等表達，提示HMGB1可促進EMT的發生[12]。HMGB1過表達可誘導腫瘤細胞由上皮表型向間質表型轉化，故沉默HMGB1基因可能抑制腫瘤的侵襲和轉移[13]。

有研究發現，HMGB1能夠通過抑制NF- κB信號通路的p63蛋白表達抑制乳腺癌細胞發生EMT，繼而阻斷乳腺癌的侵襲和轉移[14]。Zhang等[15]采用真核載體pc- DNA3.1將HMGB1轉染至卵巢癌細胞中發現，細胞中E- cadherin、VDR表達明顯降低，N- cadherin、Vimentin表達明顯上升，提示HMGB1能夠促進細胞發生EMT。既往研究認為，HMGB1過表達能夠抑制凋亡因子Caspase- 3、Caspase- 9的活性，具有抑制細胞凋亡作用[16]。Leite等[17]利用熒光素酶報告基因發現，高表達HMGB1可使NF- κB活化，并誘導抗凋亡NF- κB靶基因高表達，使抗凋亡蛋白C- IAP2 mRNA表達增加，從而增強腫瘤細胞的增殖能力。Liang等[18]通過沉默HMGB1使內皮生長因子刺激的易感性上調，導致細胞外信號調節激酶磷酸化，可加速細胞周期進展，進而促進細胞增殖。本研究采用siRNA技術沉默非小細胞肺癌A549細胞HMGB1基因，結果顯示si- HMGB1組細胞形態發生明顯改變，即從上皮表型向間質表型轉化；抑制非小細胞肺癌A549細胞HMGB1表達后，上皮標志物E- cadherin、VDR表達明顯增加，而間質標志物N- cadherin、Vimentin表達明顯降低，說明抑制HMGB1表達能夠逆轉非小細胞肺癌A549細胞EMT。推測HMGB1可能為抑制非小細胞肺癌細胞EMT的作用靶點。

TGF- β/Smad信號通路是調控器官形成和干細胞活性的重要信號通路。目前關于HMGB1與TGF- β/Smad信號通路關系的報道較少。有研究認為，TGF- β/Smad信號通路能定向調節干細胞向腫瘤發展[19，20]。蔡琳等[21]研究認為，HMGB1能夠激活NF- κB和活化素信號，進而觸發EMT。Cheng等[22]研究亦證實，上調HMGB1表達能增加TGF- β表達，并激活Snail，使Smad2/3與Smad4結合，抑制上皮細胞標志性蛋白表達和促進間質細胞標志性蛋白表達，從而促進EMT。本研究陰性對照組、空白組Snail、p- NF- κB p65蛋白相對表達量明顯高于si- HMGB1組，說明沉默HMGB1基因能夠抑制TGF- β/Smad信號通路。靶向沉默HMGB1可能通過阻斷TGF- β/Smad信號通路，逆轉非小細胞肺癌細胞EMT。

綜上所述，沉默HMGB1基因能夠逆轉非小細胞肺癌細胞EMT，其作用機制可能與阻斷TGF- β/Smad信號通路有關。

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EffectofsilencingHMGB1onepithelialmesenchymaltransitionofnon-small-celllungcancer

PUJiangtao,TANGXiaojun,SONGQi,HUZhi,HEKaiming,WUYunfei,DAITianyang

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo explore the effect of high mobility group box 1 (HMGB1) on epithelial mesenchymal transition (EMT) of non- small- cell lung cancer (NSCLC) and its mechanism.MethodsNSCLC A549 cells in the third generation were randomly divided into the si- HMGB1 group, negative control group, and blank group. Cells in the si- HMGB1 group and negative control group were transfected with HMGB1 small interfering RNA (siRNA) sequence, HMGB1 negative control siRNA transfection, and cells in the blank group were not transfected. After 72 h, the HMGB1 silencing efficiency of each group was verified. The expression of EMT- related proteins (E- cadherin, V- cadherin, Vimentin) and signal pathway- related proteins (Snail, NF- κB p65, p- NF- κB p65) in cells collected after 72- hour transfection was detected by Western blotting.ResultsThe expression of HMGB1 mRNA in the si- HMGB1 group was significantly lower than that in the negative control group and blank group (P<0.05), and there was no significant difference between the negative control group and the blank group (P>0.05). The protein expression of E- cadherin and VDR of the si- HMGB1 group was significantly higher, and the protein expression of N- cadherin and Vimentin was significantly lower than that of the negative control group and blank group (allP<0.05), and there was no significant difference between the negative control group and the blank group (P>0.05). The expression of Snail, p- NF- κB p65 protein of the si- HMGB1 group was lower than that of the negative control group and the blank group (P<0.05), and there was no significant difference between the negative control group and the blank group (P>0.05). No significant difference was found in the expression of p- NF- κB p65 among these three groups (allP>0.05).ConclusionHMGB1 silencing can reverse the EMT process in A549 cells by blocking the Snail/NF- κB signaling pathway.

non- small- cell lung cancer; high mobility group box 1; epithelial mesenchymal transition; gene silencing

衛生部醫藥衛生科技發展研究(衛技中[2011]24號)。

蒲江濤(1972- )，男，副教授，主要研究方向為肺癌、肺移植、胸部微創等。E- mail: pujiangtao72@sina.com

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.002

R734.2

A

1002- 266X(2017)36- 0005- 04

2017- 04- 21)