迷迭香酸對鼻咽癌細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制

楊沛霖，高玲，林彩霞，王巍，許立拔，巫玲玲，蔣偉哲,焦愛軍

(廣西醫科大學藥學院，南寧530021)

·論著·

迷迭香酸對鼻咽癌細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制

楊沛霖，高玲，林彩霞，王巍，許立拔，巫玲玲，蔣偉哲,焦愛軍

(廣西醫科大學藥學院，南寧530021)

目的探討迷迭香酸對鼻咽癌CNE- 1細胞(以下稱CNE- 1細胞)增殖、凋亡的影響及其可能的作用機制。方法體外培養CNE- 1細胞，取傳3代對數生長期CNE- 1細胞，隨機分為空白對照組及迷迭香酸10、20、30 μmol/L組，迷迭香酸各組分別加入含相應濃度迷迭香酸的培養液，空白對照組加入等量不含迷迭香酸的培養液。采用MTT法檢測各組培養24、48、72 h時細胞增殖抑制率。迷迭香酸作用48 h時，其濃度變化與細胞增殖抑制率的線性關系較好，故選擇迷迭香酸作用48 h進行后續實驗。取各組作用48 h細胞，采用Hochest 33258染色法觀察各組細胞形態變化，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，采用Western blotting法檢測各組PTEN、PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達。結果各組作用48 h時，隨著迷迭香酸濃度增加，細胞凋亡特征逐漸明顯。迷迭香酸各組細胞凋亡率均高于空白對照組(P均<0.05)，迷迭香酸各組間細胞凋亡率比較P均<0.05。與空白對照組比較，迷迭香酸各組PTEN蛋白表達逐漸上升，p- PI3K、p- Akt、p- mTOR蛋白表達逐漸降低，且隨著迷迭香酸濃度增加，各蛋白表達變化越明顯(P均<0.05)。而各組間PI3K、Akt、mTOR蛋白表達變化不明顯(P均>0.05)。結論迷迭香酸能劑量依賴性地抑制CNE- 1細胞增殖并誘導其凋亡，其機制可能與調控PTEN、PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。

鼻咽癌；迷迭香酸；細胞凋亡；細胞增殖；磷脂酰肌醇- 3- 激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路

鼻咽癌是我國南部省份以及東南亞地區常見的惡性腫瘤之一。由于其原發部位隱蔽，早期不易被發現，60%以上患者確診時已屬中晚期，多伴有遠處轉移。放療和化療是鼻咽癌的主要治療手段。但放療引起的放射反應和化療引起的毒副作用可嚴重影響治療效果[1，2]。近年來中藥輔助治療鼻咽癌成為研究熱點[3]。唇形科迷迭香屬植物迷迭香的全草均可入藥，具有健胃、發汗、安神、止痛之功效[4]。現代藥理學研究證實，迷迭香酸是迷迭香的主要化學成分之一，是一種天然來源的多酚羥基化合物，其具有廣泛的藥理活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等作用[5]。近年研究發現，迷迭香酸在治療黑色素瘤時能清除自由基，增強X射線電離下黑色素瘤B16F10細胞損傷，發揮放療增敏作用，而對正常細胞不僅無殺傷作用，還可能具有一定保護作用。牟宜雙等[6]研究發現，迷迭香酸可通過下調直腸癌細胞中TYMS、TK1基因表達，增強5- 氟尿嘧啶(5- FU)對癌細胞的殺傷作用，而對正常細胞則不具有殺傷作用。2016年8月～2017年1月，本課題組觀察了迷迭香酸對鼻咽癌CNE- 1細胞(以下簡稱CNE- 1細胞)增殖、凋亡的影響，現分析結果并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人高分化CNE- 1細胞，由廣西壯族自治區腫瘤防治研究所提供，本課題組液氮中保存。迷迭香酸，純度>98%，購自成都曼思特生物科技有限公司。酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；FACSCalibur流式細胞儀，美國BD公司。Hochest 33258染色液、ECL發光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術研究所；Annexin V- FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，上海美吉生物醫藥科技有限公司；Akt、p- Akt、PI3K、p- PI3K、β- actin一抗，美國Santa Cruz公司；PTEN、mTOR、p- mTOR一抗，美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的二抗，北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞培養 將CNE- 1細胞從液氮中取出，迅速放入37 ℃水浴中，快速搖震1～2 min解凍，1 000 r/min離心5 min，去上清液。將剩余全部細胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養液，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱常規培養，每2天換液1次，待細胞融合80%～90%時，按1∶3傳代。取傳3代對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3 迷迭香酸最佳作用時間篩選 取傳3代對數生長期CNE- 1細胞，0.25%胰酶消化計數，加入含10% FBS的RPMI 1640培養液稀釋，接種于96孔板，每孔1×105個，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中常規培養24 h。將細胞隨機分為4組：空白對照組及迷迭香酸10、20、30 μmol/L組，每組設6個復孔。待細胞完全貼壁后，吸棄舊培養液，迷迭香酸各組分別加入含相應濃度迷迭香酸的培養液，空白對照組加入等量不含迷迭香酸的培養液。各組培養24、48、72 h，加入5 mg/mL的MTT 20 μL，孵育4 h，吸棄上清，加入DMSO 150 μL，37 ℃充分溶解，酶標儀490 nm波長處檢測各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(空白對照孔A490值-實驗孔A490值)/空白對照孔A490值。實驗重復3次，取平均值。結果顯示，迷迭香酸對CNE- 1細胞具有增殖抑制作用，具有濃度-時間依賴性。見表1。迷迭香酸作用48 h時，其濃度變化與細胞增殖抑制率的線性關系較好，故本研究選擇迷迭香酸作用48 h進行后續實驗。

1.4 細胞分組干預及相關指標觀察

1.4.1 細胞分組干預 取傳3代對數生長期CNE- 1細胞，0.25%胰酶消化，加入含10% FBS的RPMI 1640培養液，接種于6孔板，每孔6×104個，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育24 h，吸棄舊培養液并更換新的細胞培養液。將細胞隨機分為空白對照組及迷迭香酸10、20、30 μmol/L組，迷迭香酸各組分別加入含相應濃度迷迭香酸的培養液， 空白對照組加入等量不含迷迭香酸的培養液。各組繼續培養48 h。

表1 各組不同作用時間細胞增殖抑制率比較

注：與空白對照組同時間點比較，*P<0.05；與迷迭香酸10 μmol/L組同時間點比較，#P<0.05；與迷迭香酸20 μmol/L組同時間點比較，△P<0.05；與同組作用24 h比較，▽P<0.05；與同組作用48 h比較，▼P<0.05。

1.4.2 相關指標觀察

1.4.2.1 細胞形態變化 各組培養48 h，吸棄舊培養液，PBS洗滌2次，加入1 mL固定液固定30 min；棄去固定液，PBS洗滌3次，避光條件下加入1 mL Hoechst 33258染色液染色5 min；去除染色液，PBS浸洗3次，取出蓋玻片，用抗熒光淬滅封片液封片，置于熒光顯微鏡下觀察。實驗重復3次。

1.4.2.2 細胞凋亡率 采用Annexin V- FITC/PI雙染法。各組培養48 h，用不含EDTA的胰酶消化，1 500 r/min離心5 min，去上清液，用預冷的PBS重懸細胞，然后加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，再加入5 μL Annexin V- FITC，混勻后加入5 μL PI。室溫避光反應5～15 min，1 h內上流式細胞儀檢測。實驗重復3次，取平均值。

1.4.2.3 PTEN、PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達 采用Western blotting法。各組培養48 h，收集細胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，4 ℃充分裂解30 min，12 000×g離心30 min，取上清液，BCA法進行蛋白定量。取部分蛋白加入適量上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取蛋白樣品30 μg行SDS- PAGE，120 V、28 mA電泳1.5 h；采用半干轉膜法將蛋白轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入PTEN(1∶500)、PI3K(1∶500)、p- PI3K(1∶400)、Akt(1∶500)、p- Akt(1∶400)、mTOR(1∶400)、p- mTOR(1∶400)和β- actin(1∶500)一抗，4 ℃孵育過夜；用含0.1% Tween- 20的TBS沖洗5 min×3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，用TBST漂洗15 min×3次，ECL發光顯影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶的灰度值。以β- actin為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值/β- actin蛋白電泳條帶灰度值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞形態變化 空白對照組可見均勻的淡藍色熒光，細胞體積大小一致，細胞核無明顯凋亡特征。迷迭香酸10 μmol/L組作用48 h可見部分細胞染色質呈塊狀或顆粒狀，聚集于細胞核周邊；迷迭香酸20 μmol/L組作用48 h可見較多細胞內染色質分布不均，形成熒光斑點；迷迭香酸30 μmol/L組作用48 h可見細胞碎片及凋亡小體，具有明顯的凋亡特征。迷迭香酸濃度越高，凋亡特征越明顯。見插頁Ⅰ圖1。

2.2 各組細胞凋亡率比較 空白對照組及迷迭香酸10、20、30 μmol/L組作用48 h細胞凋亡率分別為(19.210±0.024)%、(39.780±0.038)%、(56.860±0.019)%、(68.480±0.041)%。迷迭香酸各組細胞凋亡率均高于空白對照組(P均<0.05)，且迷迭香酸各組兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。

2.3 各組作用48 h時PTEN、PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達比較 見表2。

表2 各組作用48 h時PTEN、PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與迷迭香酸10 μmol/L組比較，△P<0.05；與迷迭香酸20 μmol/L組比較，#P<0.05。

3 討論

迷迭香酸是從唇形科迷迭香屬植物迷迭香中提取的天然活性成分，除具有抗炎、抗氧化等[7]藥理作用外，還具抗腫瘤作用[8]。研究發現，迷迭香酸對多種腫瘤具有抑制作用，如宮頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、結直腸癌、乳腺癌等[9～11]；其相關的作用機制亦有報道，如通過調節線粒體凋亡途徑和死亡受體途徑誘導細胞凋亡[12]、通過VEGF通路抑制腫瘤血管形成以及腫瘤細胞遷移和侵襲[13]。有研究還發現，迷迭香酸還具有放療增敏作用，可增強X射線對黑色素瘤B16F10細胞的殺傷作用。但目前鮮見迷迭香酸輔助治療鼻咽癌的報道。本研究結果顯示，隨著迷迭香酸濃度增加，CNE- 1細胞凋亡特征逐漸明顯，細胞凋亡率逐漸升高。說明一定濃度的迷迭香酸可用于輔助治療鼻咽癌。

PTEN位于人類第10號染色體上，在細胞周期調控及細胞增殖抑制中具有重要作用[14]。研究發現，PTEN蛋白異常表達與腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲和遷移等密切相關[15]。已有研究證實，PTEN是拮抗PI3K/Akt/mTOR信號通路的必要條件，PTEN通過將細胞膜上的PIP3去磷酸化生成PIP2，進而拮抗PI3K介導的細胞增殖、代謝和存活信號[16]。因此，抑制PTEN蛋白表達是抑制腫瘤生長的重要環節。Akt是位于PI3K下游的一個重要絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是維持細胞生存和正常功能的關鍵信號分子。PI3K能特異性地催化磷脂酰肌醇- 3- 羥激酶磷酸化產生具有第二信使作用的磷酸化PIP3，磷酸化的PIP3可與細胞內含有PH結構域的信號蛋白Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)結合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308，從而導致Akt活化；活化的Akt通過調控核糖體激酶p70s6k和真核起始因子4E結合蛋白1兩條不同的下游通路，控制特定亞組mRNA的翻譯，進而調節蛋白質合成，影響細胞增殖[17，18]。由此可見，PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路在腫瘤的發生、發展過程中亦具有重要作用。本研究結果顯示，隨著迷迭香酸濃度增加，PTEN蛋白表達逐漸升高，其下游的p- PI3K、p- Akt以及p- mTOR蛋白表達逐漸降低，而PI3K、Akt、mTOR蛋白表達變化不明顯。提示迷迭香酸能在一定濃度范圍內抑制CNE- 1細胞中PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路的過度活化，從而誘導CNE- 1細胞凋亡。

綜上所述，迷迭香酸能劑量依賴性地抑制CNE- 1細胞增殖并誘導其凋亡；其機制可能與調控PTEN、PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。

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RosmarinicacidsuppressescellproliferationandinducesapoptosisofhumannasopharyngealcarcinomacelllineCNE- 1

YANGPeilin,GAOLing,LINCaixia,WANGWei,XULiba,WULingling,JIANGWeizhe,JIAOAijun

(PharmaceuticalCollegeofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo investigate the effects of rosmarinic acid (RA) on cell proliferation and apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE- 1 and to identify its possible mechanism.MethodsThe human nasopharyngeal carcinoma cells line CNE- 1 were cultured in vitro and the cells of the third generation in the logarithmic phase were randomly divided into the blank control group and RA (10, 20, 30 μmol/L) treatment groups. The cells of the RA groups were cultured in nutrient solutions with different concentrations of RA, and cells in the blank control group were cultured in the same nutrient solution without RA. Each group was cultured for 24 h, 48 h, and 72 h, respectively. And then the cellular growth inhibition rate in each group was determined by MTT. After CNE- 1 cells were incubated with RA for 48 h, we found that the relationship between concentration changes of RA and the rate of cellular growth inhibition was better than others. Therefore, the following experiment was carried out after CNE- 1 cells were incubated with RA for 48 h. After that, the morphological changes of the cells were observed under a fluorescence microscope with Hoechst 33258 staining. The apoptosis rate was detected by using flow cytometry with Annexin V- FTIC/PI staining, and the protein expression of PTEN, PI3K/Akt/mTOR signaling pathway was detected by Western blotting, respectively.ResultsCompared with the blank control group, RA inhibited the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE- 1 in a dose- and time- dependent manner (P<0.05). Cells showed typical apoptosis state change and the apoptosis rate showed the way of dose- dependent manner after treatment by RA. The apoptosis rate of each RA treatment group was significantly higher than that of the blank control group (allP<0.05). Meantime, there was significant difference in the apoptosis rate among the RA treatment groups (allP<0.05). Compared with the blank control group, the protein expression of PTEN was up- regulated while the expression of p- PI3K, p- Akt, and p- mTOR were down- regulated (allP<0.05), whereas the expression of PI3K, Akt, and mTOR were not significantly changed (allP>0.05).ConclusionRA could inhibit the cell proliferation and induce the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE- 1 with a dose- dependent manner by regulating the PI3K/Akt/mTOR signal transduction pathway.

rosmarinic acid; nasopharyngeal carcinoma; cell proliferation; apoptosis; mechanism; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

國家自然科學基金資助項目(81260511)。

楊沛霖(1991- )，男，碩士，主要研究方向為新藥研究與開發。E- mail： 505489168@qq.com

蔣偉哲(1968- )，男，主任藥師，主要研究方向為新藥研究與開發。E- mail： 1263265243@qq.com 焦愛軍(1967- )，女，副主任藥師，主要研究方向為新藥研究與開發。E- mail： 807249683@qq.com

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.001

R739.6

A

1002- 266X(2017)36- 0001- 04

2017- 03- 22)