角質細胞生長因子對人齦上皮細胞在鈦金屬表面附著的影響

劉延豐　李艷娥

【摘要】 目的：探討角質細胞生長因子（KGF）對人齦上皮細胞在鈦金屬表面附著的影響效果。方法：取阻生牙拔除術患者的健康齦組織塊，經過相關處理獲取齦上皮細胞，將該細胞在純鈦片表面接種，在重組KGF濃度調配下處理，進而計數純鈦片表面附著的細胞數，測定純鈦片表面細胞的粘附力，比較接種后6 h、1 d、5 d、10 d、15 d時不同KGF濃度下純鈦片表面附著的齦上皮細胞數目，記錄KGF濃度1 ng/mL與5 ng/mL在培養1 d、10 d時齦上皮細胞在純鈦片表面粘附力與平均熒光強度（AFI）。結果：接種后同一時間點，隨著KGF濃度升高，齦上皮細胞數目明顯增多（P<0.05），同一KGF濃度下，隨著接種時間延長，齦上皮細胞數目明顯增多（P<0.05）；KGF濃度1 ng/mL與5 ng/mL時，培養1 d與10 d時齦上皮細胞在純鈦片表面粘附力與AFI比較，差異均有統計學意義（P<0.05），培養10 d時更高。結論：隨著KGF濃度升高、接種與培養時間延長，齦上皮細胞數目明顯增加，而且附著力也會隨著KGF濃度升高而升高，在時間-濃度變化中，AFI也呈現隨之增高趨勢，可見KGF對人齦上皮細胞在鈦金屬表面附著影響較大，需加強重視。

【關鍵詞】 角質細胞生長因子； 人齦上皮細胞； 鈦金屬； 表面附著； 接種

Effects of Keratinocyte Growth Factor on Adhesion of Human Gingival Epithelial Cells on Titanium Surface/LIU Yan-feng，LI Yan-e.//Medical Innovation of China，2017，14（30）：051-054

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of keratinocyte growth factor（KGF） on adhesion of human gingival epithelial cells on titanium surface.Method：The gingival epithelial cells were obtained from the patients with impacted teeth，and the gingival epithelial cells were obtained by related treatment，they were inoculated on the surface of pure titanium sheets，processed under the concentration of recombinant KGF，the number of cells attached to the surface of pure titanium sheets was counted，and the adhesion force of the cells on the surface of pure titanium sheets was measured.The number of gingival epithelial cells adhered to pure titanium slices at different concentrations of KGF at 6 h，1 d，5 d，10 d and 15 d after inoculation were compared，the adhesive force and average fluorescence intensity（AFI） of gingival epithelial cells on pure titanium sheets at l ng/mL and 5 ng/mL of KGF concentration at 1 d and 10 d were recorded.Result：At the same time point after inoculation，the number of gingival epithelial cells increased significantly with the increase of KGF concentration（P<0.05）.At the same KGF concentration，the data of gingival epithelial cells increased significantly with the extension of inoculation time（P<0.05）.When the concentration of KGF was 1 ng/mL and 5 ng/mL，the adhesion force and AFI of gingival epithelial cells on pure titanium surface were compared at 1 d and 10 d，the differences were statistically significant（P<0.05），and the higher at 10 d.Conclusion：With the increase of KGF concentration，inoculation and incubation time，the number of gingival epithelial cells increased significantly，and the adhesion also increased with the increase of KGF concentration，in the time-concentration change，AFI also showed a trend of increasing，it showed that KGF had a great influence on the attachment of human gingival epithelial cells on the surface of titanium，so we should pay more attention to it.endprint

【Key words】 Keratinocyte growth factor； Human gingival epithelial cell； Titanium； Surface attachment； Inoculation

First-authors address：Stomatological Hospital of Jiangmen City，Jiangmen 529000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.30.015

種植體表面的上皮附著是種植牙成功的關鍵。阻生齒拔除后口腔表面上皮可能往牙面爬行生長，而且重新分化結合生皮，或者出現新的結合上皮，并可分泌出基底膜，形成新的上皮附著，稱之為上皮再附著，組織主要源于口腔齦上皮[1-3]。隨著人們對齦上皮細胞的了解增多，臨床對其興趣也逐漸增加，尤其是其在鈦金屬表面的附著情況[4-6]。角質細胞生長因子（KGF）被證實有著促進上皮細胞增生的效果[7-9]，為了進一步探討KGF對人齦上皮細胞在鈦金屬表面附著的影響情況，本文進行了如下研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源與鑒定

1.1.1 來源 選擇阻生齒拔除患者健康齦組織塊，利用4 ℃、0.25%分離酶進行16 h作用，分離齦上皮組織及其下結締組織，采取0.125%胰酶消化上皮片形成一種單一的人齦上皮細胞單細胞懸液，進行體外原代培養、傳代培養，每天利用倒置顯微鏡對其細胞形態實施觀察與記錄。

1.1.2 鑒定 傳代培養第10天，取長齦上皮細胞的蓋玻片實施抗角蛋白免疫組化染色處理，其中一抗選擇1∶500的兔抗人角蛋白多克隆抗體，二抗體選擇生物素標記的鼠抗兔IgG。此外，取分離酶處理前后的齦上皮組織實施HE染色，將分離酶作用后的組織采取抗角蛋白免疫組化染色。本次研究中染色必須按照細胞的形態與抗角蛋白處理，確認最終培養所得的細胞為齦上皮細胞。

1.2 細胞接種與濃度調配

1.2.1 細胞接種 將純鈦片打磨成和ITI種植體頸部光滑度相似的情況，而且表面的粗糙程度也要和ITI種植體頸部表面粗糙程度相同（采取粗糙度測量儀測定）。將消毒后備用的純鈦片放置在24孔板上進行培養。

1.2.2 濃度調配 純鈦片上接種的細胞濃度初始為1×106/mL，每片純鈦片表面滴入100 μL細胞懸液，靜置2 h后將0.9 mL培養液加入其中，然后加入不同劑量的角質細胞生長因子，將細胞因子最終濃度控制在5個水平進行常規培養，包括0、1、5、10、50 ng/mL。

1.3 細胞數計數 在細胞接種后6 h、1 d、5 d、10 d、15 d將純鈦片取出，進行PBS沖洗，利用計算機圖像進行系統分析，計算每平方毫米純鈦片表面黏附的細胞數目，各個時間點、不同的濃度情況下均抽取樣品15個進行計數，最終數據為均值。

1.4 粘附力測定 從細胞接種開始后第1天、第10天分別將培養液取出1 ng/mL與5 ng/mL濃度的角質細胞生長因子，進行PBS沖洗后，利用細胞微管吸吮系統對單個齦上皮細胞在純鈦片上的粘附力進行測定，不同濃度下取樣本5個，每個樣本進行2個細胞測定。

1.5 熒光強度測定 接種第1天、第10天取培養液濃度1 ng/mL與5 ng/mL的純鈦片，實施PBS沖洗后以0.15%胰酶消化，收集細胞并調整其濃度到1×104/mL，將兔抗人層粘連蛋白單抗與鼠抗兔FITC標記熒光抗體，測定平均熒光強度（AFI），不同濃度下取樣本10個。

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組比較采用F檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間、不同KGF濃度下純鈦片表面人齦上皮細胞附著數目比較 接種后同一時間點，隨著KGF濃度升高，齦上皮細胞數目明顯增多（P<0.05），同一KGF濃度下，隨著接種時間延長，齦上皮細胞數目明顯增多（P<0.05），見表1。

2.2 齦上皮細胞在KGF濃度1 ng/mL與5 ng/mL時培養1 d與10 d時純鈦片表面粘附力與AFI比較 KGF濃度1 ng/mL與5 ng/mL時培養1 d與10 d時齦上皮細胞在純鈦片表面粘附力與AFI比較，差異均有統計學意義（P<0.05），培養10 d時更高，見表2。

3 討論

1987年國外學者提出表面賽跑理論，指出組織細胞與細菌在生物材料表面會出現競爭性附著，若組織細胞先附著在生物材料表面，則組織-材料界面則是由完整細胞膜、細胞活力、多糖、宿主功能性防御抵抗細菌進行粘附，反之若細菌先附著，則會誘發感染，而且細胞難以再與生物材料附著[10-13]。牙科種植體屬于比較常用的方式，植入后，表面會有菌叢附著，若齦上皮細胞無法在種植體表面形成粘附，便可能造成周圍炎，甚至導致種植體失敗。可見，齦上皮細胞在種植體表面早期粘附是種植體成功關鍵，研究發現，KGF特異刺激上皮細胞的增殖與分化可能會促進其早期粘附[14-16]。

在本文中針對角質細胞生長因子對人齦上皮細胞在鈦金屬表面附著影響情況進行了分析，取阻生牙拔除術患者的健康齦組織塊，經過相關處理獲取齦上皮細胞，將該細胞在純鈦片表面接種與重組人角質細胞生長因子濃度調配下處理，進而計數純鈦片表面附著的細胞數，測定純鈦片表面細胞的粘附力，本文研究結果顯示：接種后同一時間點，隨著KGF濃度升高，齦上皮細胞數目明顯增多（P<0.05），同一KGF濃度下，隨著接種時間延長，齦上皮細胞數目明顯增多（P<0.05）；KGF濃度1 ng/mL與5 ng/mL時培養1 d與10 d時齦上皮細胞在純鈦片表面粘附力與AFI比較，差異均有統計學意義（P<0.05），培養10 d時更高。角質細胞生長因子屬于成纖維細胞生長因子家族成員之一，有著163個氨基酸殘基的單鏈多肽，和靶細胞膜特異性受體結合后會發揮自身的生物學作用[17]。上皮細胞有合成與分泌角質蛋白的作用，其鑒定方法之一為抗角蛋白免疫組化染色[18]。在本次研究中細胞抗角蛋白免疫組化染色結果為陽性，細胞質呈現棕黃色，在細胞內的顆粒狀（陽性）可認為是齦上皮細胞，從而使得結果更可靠。本研究結果顯示，隨著時間推移、濃度升高，鈦金屬表面附著的KGF數目會明顯增多，而且附著粘附力也會增加，FAI也會升高。但在一些研究中指出，接種15 d時，隨著KGF濃度升高，附著的細胞數目略微增多，顯示有一定的維持增殖能力，但過度增殖會造成上皮細胞根向遷移，使得骨界面形成出現破壞，反而不利于種植體融合[19-20]。endprint

綜上所述，隨著KGF濃度升高、接種與培養時間延長，齦上皮細胞數目明顯增加，而且附著力也會隨著KGF濃度升高而升高，在時間-濃度變化中，AFI也呈現隨之增高趨勢，可見KGF對人齦上皮細胞在鈦金屬表面附著影響較大，需加強重視。

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（收稿日期：2017-09-12） （本文編輯：董悅）endprint