MMP—2、P53蛋白在大鼠實驗性蛛網膜下腔出血后早期腦損傷中的作用研究

單宏寬　劉剛　徐法東

【摘要】 目的：建立大鼠蛛網膜下腔出血（SAH）動物模型，檢測腦組織中MMP-2及P53蛋白的表達水平及腦組織細胞凋亡情況，探討MMP-2和P53蛋白在蛛網膜下腔出血后早期腦損傷中的作用機制。方法：72只SD大鼠隨機分成假手術組、實驗組。實驗組又分為出血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d共5個時相組，每個時相組各12只大鼠。各組標本分別檢測MMP-2及P53蛋白在海馬CA1區的表達水平，海馬CA1區神經細胞凋亡情況。結果：實驗組海馬CA1區MMP-2、P53蛋白表達及凋亡細胞數較假手術組均有增高，以24、48 h組更為顯著。結論：MMP-2和P53蛋白在大鼠蛛網膜下腔出血后腦組織中表達明顯增多，神經元細胞凋亡顯著，兩者與早期腦損傷關系密切，可能與MMP-2降解細胞外間質，破壞血腦屏障，導致血腦屏障通透性增高，P53蛋白誘導神經細胞凋亡有關。

【關鍵詞】 蛛網膜下腔出血； MMP-2； P53蛋白； 細胞凋亡

【Abstract】 Objective：To study the MMP-2 and P53 in the role of early brain injury after subarachnoid hemorrhage preliminary by detecting MMP-2 and P53 protein expression level and apoptosis in brain tissue in order to provide a theoretical basis for treatment of subarachnoid hemorrhage in clinical practice.Method：72 clean-level male SD rats were randomly divided into sham-operated group（n=12） and SAH group（n=60）.SAH group were randomly divided into 12 h，24 h，48 h，3 d and 5 d group，12 rats in each group.The MMP-2 and P53 protein expression levels and neurocyte apoptosis in hippocampus CA1 were detected.Result：The MMP-2，P53 protein and the number of apoptotic cells in hippocampus CA1 of SAH group in each time were increased compared with those of sham-operated group，the differences were the most significant at the 24 and 48 h group.Conclusion：MMP-2 and P53 protein are closely related to early brain injury after subarachnoid hemorrhage by the former，MMP-2 increasing the permeability of blood-brain barrier by degradation of extracellular matrix to destroy blood-brain barrier，and the latter P53 protein，inducing the neurocyte apoptosis.

【Key words】 Subarachnoid hemorrhage； MMP-2； P53 protein； Apoptosis

First-authors address：Liaocheng Central Hospital of Shandong Province，Liaocheng 252000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.008

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是神經系統常見的急危重癥，年發病率為（2～16）/10萬[1]，且近30年來發病率呈上升趨勢[2]，最常見的病因是顱內動脈瘤破裂，約占所有自發性蛛網膜下腔出血發病原因的34%[3-4]，約35%患者在SAH后24 h內死亡，與顱內動脈瘤破裂出血導致的早期腦損傷密切相關[5-6]，但SAH后早期腦損傷的機制卻知之甚少。SAH后多會出現腦水腫、顱內壓升高、腦血管痙攣及血-腦脊液屏障損壞等多種病理生理改變[7]。文獻[8]2004年提出，蛛網膜下腔出血后EBI是早期致死致殘的主要原因。相關研究認為EBI是多因素、多途徑的病理過程，其中神經細胞和血管內皮細胞凋亡起重要作用，但確切機制尚不明了[8-9]。因此，探討SAH后早期腦損傷的機制，進而早期進行有效的藥物干預和治療成為臨床急待解決的問題和重要的研究方向。本實驗通過檢測MMP-2、P53蛋白在大鼠SAH模型腦組織中的表達和神經細胞凋亡的情況，旨在從分子水平來探討二種蛋白在大鼠SAH后腦組織中表達的變化，及其與EBI的發生、發展過程之間可能的相互作用機制，為臨床工作中對SAH進行早期治療提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取72只蛛網膜下腔出血模型SD大鼠隨機分成假手術組、實驗組。實驗組又分為出血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d共5個時相組，每個時相組各12只大鼠。各組標本分別檢測MMP-2及P53蛋白在海馬CA1區的表達水平，海馬CA1區神經細胞凋亡情況。endprint

1.2 方法 （1）按SABC法進行免疫組化染色，檢測MMP-2及P53蛋白在海馬CA1區的表達水平。MMP-2表達陽性細胞胞漿著色呈棕黃色，P53陽性細胞為細胞漿和細胞核均染成棕黃色，但胞漿著色較輕。選取海馬CA1區相應的區域，每個區域選取5個×400鏡下視野，計數陽性細胞個數，取平均值，采用生物醫學分析系統進行定量分析，分析各組陽性細胞表達程度的差異。（2）TUNEL染色檢測海馬CA1區神經細胞凋亡情況，凋亡結果判定：細胞核中有棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細胞，即凋亡細胞。陽性反應的細胞定量采用imane-proplus軟件系統，每只大鼠取海馬CA1區切片觀察，取切片中海馬CA1區相互不重疊的5個視野，×400倍視野下計數陽性細胞平均個數。結果采用彩色醫學圖象分析系統和Nikon UFX-IIA熒光/光學顯微鏡及顯微照相機進行海馬CA1區陽性細胞記數（個/×400倍視野）。

1.3 觀察指標 海馬CA1區MMP-2及P53蛋白的表達水平，海馬CA1區神經細胞凋亡情況。

1.4 統計學處理 使用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析，計量資料采用（x±s）表示，數據采用ONE WAY ANOVA對每個時間點上6個分組的數據進行重復測量資料單因素方差分析，進行假手術組和不同時相組的兩兩比較。以單側P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 蛛網膜下腔出血后海馬CA1區MMP-2的表達 假手術組神經元細胞排列緊密，偶可見到少量的MMP-2表達（1.04±0.95）個/×400倍視野，SAH組海馬CA1區MMP-2在12 h時可見明顯表達（21.19±1.75）個/×400倍視野，胞漿黃染，在24 h達到高峰（32.35±2.63）個/×400倍視野，以后表達稍有下降，直到48 h時仍保持較高水平（28.46±2.74）個/×400倍視野，第3天開始明顯減少（13.71±1.73）個/×400倍視野，第5天為（9.11±1.16）個/×400倍視野。SAH后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d組與假手術組相比較差異均有統計學意義（P<0.01）。假手術組和SAH后各時間組海馬區MMP-2的表達結果，見圖1～6。

2.2 蛛網膜下腔出血后海馬區P53的表達 假手術組海馬CA1區神經細胞數量較多，細胞間緊密排列，偶可見到少量P53的表達（0.85±0.84）個/×400倍視野，SAH組海馬CA1區P53表達在12 h時顯著呈陽性表現（24.05±1.54）個/×400倍視野，胞核染色明顯，至24 h達到高峰（33.998±2.02）個/×400倍視野，直到48 h時仍保持較高水平（30.20±1.29）個/×400倍視野，3 d以后表達稍有下降（18.15±1.51）個/×400倍視野，第五天為（13.82±1.33）個/×400倍視野。SAH后海馬CA1區12 h、24 h、48 h、3 d、5 d組與假手術組相比較差異均有統計學意義（P<0.01）。假手術組和SAH后各時間組海馬CA1區P53表達結果，見圖7～12。

2.3 蛛網膜下腔出血后海馬CA1區細胞凋亡 假手術組大鼠海馬區可見到少量神經元細胞凋亡（1.29±1.22）個/×400倍視野，蛛網膜下腔出血組海馬CA1區神經元細胞凋亡在12 h時明顯升高（30.47±2.28）個/×400倍視野，24 h時達到高峰（42.02±2.19）個/×400倍視野，光鏡下可見大量凋亡細胞，核縮小、呈棕黃色，局部神經元脫失，呈篩網狀，淋巴細胞浸潤，膠質細胞大量增生，神經元脫失隨時間延長更加明顯，48 h后逐漸減少（37.95±2.05）個/×400倍視野，3 d為（22.997±2.28）個/×400倍視野，至第5天可見神經元細胞顯著減少，主要為凋亡細胞（18.18±1.41），且排列稀疏。SAH后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d與假手術組相比較差異均有統計學意義（P<0.01）。假手術組和SAH后各時間組海馬區神經細胞凋亡結果，見圖13～18。

3 討論

3.1 蛛網膜下腔出血后早期腦損傷目前研究現狀的探討 EBI是蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后72 h內腦作為一個整體發生的直接損傷涉及到遲發性腦血管痙攣出現（3 d～2周）之前腦組織內所發生的病理生理事件[10]，包括腦組織細胞死亡，血腦屏障破壞，腦水腫，顱內壓增高，急性腦血管痙攣，微血管功能障礙腦血流下降等[8，11]。早期腦損傷不但對患者產生致命性傷害，而且與是否留有后遺癥密切相關。由于大部分重度SAH患者尚未得到及時有效的救治就早期死亡，有關SAH后早期腦損傷的研究資料較少，有關SAH早期研究資料顯示：尸檢發現SAH急性期死亡患者有全腦彌漫性腦梗死，PTE檢測亦發現SAH急性期患者存在不同程度的腦缺血及其引發的腦能量代謝障礙[12]。臨床雖然無法觀察到最初發生SAH時大腦微血管收縮、顱內壓和腦血流的變化情況，但實驗性SAH腦血管結構解剖學改變已經通過驗證并發現額外管腔變化造成腦灌注不足[13]。因此，SAH急性期發生全腦血流量瞬間快速降低，繼而緩慢恢復的腦缺血再灌注模式，既可能存在由于單純腦缺血所導致的能量代謝不足，又可能存在腦缺血再灌注所致的損傷，是SAH后早期唯一可能觀察到的腦損害因素，對這種腦缺血損傷的模式進行深入研究有助于揭示SAH后早期腦損傷的發病機理。

3.2 SAH早期腦損傷與基質金屬蛋白酶-2（MMP-2） SAH出血后，腦組織處于嚴重缺血、缺氧狀態，繼而顱內壓、腦灌注壓和全腦血流量按各自的變化節律逐漸恢復，此過程中大腦作為整體主要受到缺血再灌注損傷。腦毛細血管基底膜是維持血腦屏障完整性的重要結構基礎，主要由Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等構成。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是MMPs家族的成員，為72KDⅣ型膠原酶（又稱明膠酶A），參與組織發育和維持內環境穩定中的組織重塑過程，亦能夠通過降解細胞外基質、調節細胞粘附以及轉導細胞外環境中細胞表面蛋白的脫落等途徑調節細胞活性。Hamann等[14]報道早在腦缺血/再灌注2 h后MMP-2即通過消化腦微血管內皮細胞基底膜，改變內皮細胞間的緊密連接，導致BBB的開放。故腦缺血及再灌后MMPs出現陽性表達明顯增強，尤其是MMP-2活性增加，與腦微血管通透性增加、BBB通透性增大、BBB的屏障作用破壞、炎性細胞侵入和腦水腫明顯相關。endprint

本研究結果顯示假手術組大鼠海馬CA1區MMP-2未見明顯表達，實驗組大鼠12 h MMP-2表達增加，兩者比較差異有統計學意義（P<0.05）。實驗組大鼠海馬CA1區陽性細胞數量至24 h達到高峰，表現為細胞絕對數量較假手術組減少，大多數細胞胞漿黃染，細胞之間間隙增大，排列疏松，24 h之后陽性表達的細胞數量逐漸下降，證明SAH后MMP-2在腦血管基底膜破壞的病理過程中存在陽性表達，MMP-2通過降解腦血管基底膜，導致BBB的通透性改變，促使早期腦損傷發生。

3.3 SAH早期腦損傷與P53蛋白誘導細胞凋亡 凋亡是蛛網膜下腔出血后早期腦損傷的主要的病理生理過程之一，有實驗表明，SAH發生后10 min內神經元細胞就開始發生凋亡[15]。本實驗經TUNEL染色發現各實驗組海馬CA1區均有不同程度的細胞凋亡，以24 h組表現最為明顯，進一步證實了SAH后急性期的確存在缺血再灌注損傷，并由此引發神經元細胞凋亡。腦缺血再灌注損傷后，參與細胞凋亡的因素有很多，近年來的研究表明，P53與細胞凋亡有密切關系[16-17]，P53基因是一種抑癌基因，在細胞增殖、分化等過程中起著至關重要的作用，目前認為P53是引發細胞凋亡連鎖反應中第一位的決定因素。有研究表明，P53基因通過調控bcl-2誘導細胞凋亡，SAH后BMEC凋亡的發生與促凋亡的P53蛋白密切相關，P53表達程度與細胞凋亡程度呈正相關[18]。Yuksel等[19]發現，腦缺血發生后死亡受體的配體Fas和TNF的表達上調與死亡受體結合后可激活caspase級聯反應，其主要機制之一為死亡受體穩定胞質內的P53。相關研究亦發現大鼠腦缺血后60 min，大腦皮層即開始有P53表達增加，24～48 h達高峰，這與細胞凋亡時間一致，且在一定時間內二者呈正相關，說明P53的表達在腦缺血細胞凋亡過程中起一定作用[20]。Yan等[21]通過siRNA干擾P53正向凋亡調控因子（P53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA）抑制P53的表達，SAH后BMEC凋亡明顯減少。以上結果表明，SAH可誘導P53蛋白表達，P53蛋白對出血后早期腦損傷神經細胞凋亡起促進作用。本研究結果顯示對照組大鼠海馬CA1區未見明顯P53陽性細胞表達，實驗組大鼠海馬CA1區在注血后12 h即可檢測到P53陽性表達細胞，兩者比較差異有統計學意義（P<0.05），24 h時P53蛋白表達達到高峰，鏡下可見CA1區細胞數量較假手術組減少，陽性細胞胞核黃染，核仁縮小或碎裂，細胞之間間隙增大，排列疏松，48 h時可見P53陽性表達細胞輕度減少，3 d時減少明顯，與假手術組比較差異有統計學意義（P<0.05）。P53蛋白表達與TUNEL染色結果中細胞凋亡的高峰同時出現，且與神經細胞凋亡的分布大致相符，證明P53蛋白在蛛網膜下腔出血后異常高表達，誘導神經元細胞凋亡，在EBI發病過程中產生促進作用。

本試驗只是對SAH后早期腦損傷、腦組織神經元的凋亡機制做了初步的探討，關于SAH后出現腦損傷及細胞凋亡的確切機制尚需進一步研究，但不可否認的是，MMP-2和P53蛋白在血腦屏障破壞、大腦皮質和海馬神經元凋亡的進程中可能起著重要的作用。從研究SAH早期腦損傷出發，探究SAH早期腦損傷的病理機制以及有效的腦保護措施，不僅為臨床上防治SAH后EBI提供理論基礎，為 SAH 的治療提供新的思路，也將為重度SAH患者如何盡早采取有效的干預措施，進行腦動脈瘤和遲發性腦血管痙攣的進一步治療爭取更多的機會。

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（收稿日期：2017-03-20） （本文編輯：周亞杰）endprint