微生態制劑對小鼠受損腸道的修復作用

馬寧　張志宏　錢爽

【摘要】 目的：探究微生態制劑對小鼠腸道損傷后的修復作用。方法：將小鼠分5組，每組10只，對1～4組小鼠進行腹腔注射順鉑，1 mL/100 g，造受損腸道模型。然后分別用乳酸菌、功能寡糖、乳酸菌和功能寡糖混合、飲用水（陽性對照）喂養1～4組小鼠，第5組小鼠作陰性對照，常規飼料飼養。2周后比較各組小鼠小腸石蠟切片和離體小腸平滑肌收縮能力。結果：乳酸菌和功能寡糖混合3組，切片觀察小腸黏膜細胞排列緊密，小腸平滑肌收縮力最強。結論：乳酸菌與功能寡糖制劑能有效修復損傷后小腸，增強小腸蠕動。

【關鍵詞】 微生態制劑； 功能寡糖； 修復作用

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of microecological preparation on intestinal damaged mice.Method：Divided mice into 5 groups，10 mice in each group，group 1-4 made the model of the damaged intestine mice by intraperitoneal injected cisplatin 1 mL/100 g，and fed with lactic acid bacteria，functional oligosaccharides，lactic acid bacteria and functional oligosaccharides，drinking water（positive control group）respectively，group 5 as negative control.After 2 weeks，the small intestine paraffin sections and the contractility of isolated small intestinal smooth muscle were compared.Result：Intestinal mucosa cells of the mice fed with lactic acid bacteria and functional oligosaccharides（group 3）were arranged closely and the contractility of isolated small intestinal smooth muscle was the strongest.Conclusion：Lactic acid bacteria and functional oligosaccharide can repair small intestine damaged and enhance its peristalsis effectively.

【Key words】 Microecologics preparation； Functional oligosaccharide； Repairing function

First-authors address：School of Pharmacy Linyi University，Linyi 276000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.007

微生態制劑，是利用正常微生物或促進微生物生長的物質制成的活的微生物制劑[1-3]。也就是說，一切能促進正常微生物群生長繁殖及抑制致病菌生長繁殖的制劑都稱為微生態制劑[4-5]。乳酸菌作為重要的益生菌來源，主要通過恢復或增強腸道穩態發揮作用，是一類具有佐劑活性的非病原細菌，并有作為黏膜疫苗載體使用的潛能[6]。其中雙歧桿菌是人類腸道菌群中唯一的一種既不產生內毒素又不產生外毒素，無致病性的具有許多生理功能的有益微生物[7]。功能性低聚糖是腸道內有益菌的增殖因子，其中最明顯的增殖對象是雙歧桿菌，因為雙歧桿菌細胞表面具有寡糖的受體，而許多寡糖是有效的雙歧因子。本實驗主要比較不同組合的幾種微生態制劑對受損腸黏膜的修復作用，優化最佳組合方案，以此維護腸道健康，提高患者的生存質量，為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇同批次的KM小鼠，雌雄各半，體重（28±2）g，購于山東省農業科學院畜牧獸醫研究所。

1.1.2 藥品及試劑 順鉑（10 mL/支，批號：H37021358）購自齊魯制藥有限公司；低聚異麥芽糖（食品級，純度：99.8%），購自安徽中南生物科技有限公司；乳酸菌（含雙歧桿菌BB-12、保加利亞乳桿菌、嗜熱乳鏈球菌等，產品標準號Q/TZCXG0001）北京川秀科技有限公司。配制

1000 mL臺氏液（Tyrode），含：NaCl 8.0 g、10% KCl

2.0 mL（0.2 g）、10% MgSO4·7H2O 2.6 mL（0.26 g）、5% NaH2PO4·2H2O 1.3 mL（0.065 g）、NaHCO3 1.0 g、1M CaCl2 1.8 mL（0.2 g）、葡萄糖1.0 g。（注意：CaCl2溶液須在其他基礎溶液混合并加蒸餾水稀釋之后，方可一面攪拌一面逐滴加入，否則將生成鈣鹽沉淀，葡萄糖應在臨用時加入，加入葡萄糖的溶液不能久置）。FAA固定液：40%的甲醛溶液5 mL，70%乙醇90 mL，冰醋酸5 mL。

1.1.3 儀器 BL-420F生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；HHQ-3658電腦組織切片機（金華市華海科教儀器廠）；水浴恒溫振蕩儀（金壇市億通電子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將小鼠分為5組，每組10只，取回后先進行適應性飼養2 d。前4組小鼠進行腹腔注射順鉑，1 mL/100 g，造受損腸道模型。然后分別用乳酸菌、功能寡糖、乳酸菌和功能寡糖混合、飲用水（陽性對照）喂養1、2、3、4組小鼠，第5組小鼠作陰性對照，常規飼料飼養。1周后第4、5組各取2只，脫臼處死取小腸，顯微鏡觀察并進行石蠟切片比較兩組不同，判定模型組制備效果。模型制備成功后，實驗組分別在飲用水中添加混合菌制劑，混合菌和功能寡糖，功能寡糖。乳酸菌的濃度為104CFU/mL，功能寡糖濃度為5 g/100 mL，2周后處死剩余小鼠并進行小腸石蠟切片和測離體小腸平滑肌收縮力。endprint

1.2.2 小鼠小腸石蠟切片的制備 小鼠用頸椎脫臼法處死，剖腹取出粗細適宜的小腸2～3 cm若干段，修塊5 mm×5 mm×2 mm，立即投入生理鹽水中，用滅菌注射器吸取少量生理鹽水，不斷沖洗腸腔直至無任何雜物。立即投入FAA固定液中固定25 min，56 ℃、振速100 次/min恒溫振動固定；在37 ℃恒溫振蕩儀中進行脫水70%、80%乙醇溶液脫水各20 min、95%乙醇溶液Ⅰ、Ⅱ缸脫水各15 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸脫水各10 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ缸透明5 min，65 ℃振動；浸蠟包埋58～60 ℃，15 min，切片，縱切厚度3～4 m，45 ℃水溫展開，潔凈的載玻片上涂上一層薄薄蛋白甘油，把展開的切片貼在上面，裱好的石蠟切片，60 ℃烤25～30 min；染色：石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ缸各10 min，然后放入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各10 min，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇2 min，再放入蒸餾水中1 min[8]。切片HE染色后在顯微鏡下觀察各組小腸絨毛的變化。

1.2.3 小鼠小腸離體平滑肌生理活性測定 取實驗后的小鼠，禁食24 h后，用頸椎脫臼法處死。迅速沿腹中線打開腹腔，每只小鼠取十二指腸同一腸段放入盛有混合氣體的飽和臺式液中，洗凈腸內容物。將其剪成2～3 cm的腸段作為實驗標本。打開BL-420E生物機能實驗系統，調零，定標，在一通道輸入接口處安裝張力換能器。調節恒溫平滑肌槽，使水溫保持在（37±0.5）℃，將臺式液加入預管內，藥物管加入16 mL臺氏液。將標本一端固定于L型通氣鉤上，另一端連接張力換能器，持續通入混合氣體（96% O2，4% CO2），氣泡1～2個/s，溫度37 ℃，待腸管運動穩定后，開始進行實驗測定離體小腸平滑肌的頻率和振幅。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠小腸石蠟切片觀察 圖1可以看出小腸黏膜纖毛排列緊密，圖2纖毛損傷較為嚴重。圖3基本和正常情況下的小腸切片一致，圖4纖毛損傷情況較前一組嚴重，圖5黏膜間出現裂縫，說明有部分組織損傷。說明微生態制劑可以有效修復受損腸黏膜組織。

2.2 各組小鼠離體小腸平滑肌收縮力測定比較 與陰性對照5組比較，1～4組小鼠小腸頻率增加的百分比分別是-9%，-22%，6%，-39%，而1～3組與陽性對照4組比較增加的百分比分別是48%，27%，74%，比較差異均有統計學意義（P<0.05），這充分說明乳酸菌與功能寡糖混合可以充分修復被放化療藥物破壞的小鼠小腸，甚至在其修復的基礎上增加了其平滑肌的收縮頻率，修復小腸的蠕動能力，促進消化吸收。與陰性對照5組比較，1～4組小鼠小腸振幅增加的百分比分別是50%，5%，11%，-56%，而1～3組與陽性對照4組比較，增加的百分比分別是237%，138%，150%，差異均有統計學意義（P<0.05），這說明乳酸菌與功能寡糖混合可以充分修復被放化療藥物破壞的小鼠小腸，在增加其收縮頻率的基礎上增大其振幅。由此可知微生態制劑可以有效修復小鼠小腸平滑肌振動頻率及振幅，促進消化和吸收，見表1。

3 討論

本實驗研究確定由乳酸菌和功能寡糖配制成的微生態制劑對腸黏膜的保護作用效果最佳。究其原因在于乳酸菌細胞、細胞壁成分和胞外分泌物可增強免疫細胞的活性，促使腸道免疫蛋白A（IgA）漿細胞的產生，從而殺滅侵入體內的細菌和病毒，消除體內“病變”細胞，防止疾病的發生及惡化[9-10]。某些功能性低聚糖，如異麥芽低聚糖，攝入人體后到大腸被雙歧桿菌及某些乳酸菌利用，而腸道有害的產氣莢膜桿菌和梭菌等腐敗菌卻不能利用，從而保護腸黏膜[11-13]。

近年來，癌癥患者與日俱增，放化療是臨床目前治療癌癥主要的方式，但是隨著大劑量放化療在臨床應用范圍的擴大，所引起的不良反應也越來越明顯[14-16]。影響正常組織細胞，引起機體免疫力下降尤其是消化道的損傷，據報道，40%的癌癥患者死于營養不良。而微生態制劑能有效修復損傷的小腸，提高小腸的收縮能力，促進小腸的蠕動，從而有效緩解癌癥患者的消化不良等問題，并且能調節腸道內菌群平衡，從而大大增加癌癥患者的存活率，提高患者生存質量[17-20]。

綜上所述，本實驗通過化療藥物順鉑制備的腸道受損模型在一定程度上反映了化療藥物引起消化道不良反應的一些特征，并利用外源性的添加部分有益的活菌制劑能在短時間內使得多種菌群的達到均衡。說明在臨床長期使用放化療的情況下，適當補充外源性有益活菌制劑可適當調節腸道菌群的平衡，增強腸道平滑肌收縮功能，有利于疾病的康復。

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（收稿日期：2017-05-18） （本文編輯：康玥）endprint