野茼蒿對UC大鼠血清黏附分子表達(dá)的影響

彭凡珂　馮陳慧　寇力丹

【摘要】 目的：通過研究野茼蒿對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清相關(guān)黏附分子表達(dá)的影響，探討其對潰瘍性結(jié)腸炎的療效。方法：選擇2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）與乙醇混合液誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠為研究對象，把UC模型大鼠分為：空白對照組、模型組，野茼蒿低、中、高劑量組，陽性對照組，每組各12只。每天給予各組不同藥物處理。于給藥21 d后對大鼠結(jié)腸組織進(jìn)行CMDI和HS評分，并用ELISA法檢測血清黏附分子CD62P、PSGL-1、CD44、CD54的含量，比較各組間指標(biāo)差異。結(jié)果：與空白組相比，模型組CMDI評分和HS評分以及血清中黏附分子CD62P、PSGL-1、CD44、CD54明顯升高（P<0.01或P<0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠上述兩個評分以及黏附分子含量一定程度上降低（P<0.01或P<0.05）；與模型組相比，SASP組大鼠血清述兩個評分以及黏附分子的含量明顯降低（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論：野茼蒿凍干粉對UC大鼠有一定的治療作用，其機(jī)制可能與影響CD62P、PSGL-1、CD44、CD54的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 潰瘍性結(jié)腸炎； 野茼蒿； 血清黏附分子

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Wild Chrysanthemum on the expression of serum-related adhesion molecules in rats with ulcerative colitis and to explore its effect on ulcerative colitis.Method：The rats of ulcerative colitis induced by 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid（TNBS） and ethanol were selected as the study subjects.The UC rats were divided into six groups：blank group，model group，wild chrysanthemum Low，medium and high dose group，positive control group，12 cases in each group.Each group was given a different medication every day.At 21 days after administration，CMDI score and HS score were performed on rat colon tissue.The levels of CD62P，PSGL-1，CD44 and CD54 in serum were measured by ELISA.The differences of six groups were compared and analyzed statistically.Result：Compared with the blank group，the CMDI scores and HS scores and the levels of CD62P，PSGL-1，CD44 and CD54 in the serum of the model group were significantly increased（P<0.01 or P<0.05）；compared with the model group，the two scores and the levels of adhesion molecules in serum of the low，medium and high dose rats groups were significantly lower（P<0.01 or P<0.05）；compared with the model group，the above two scores and the content of adhesion molecules in serum of SASP group were significantly decreased（P<0.01 or P<0.05）.Conclusion：The freeze-dried powder of Wild Chrysanthemum has a certain therapeutic effect on the clinical symptoms of UC rats.The mechanism may be related to the expression of CD62P，PSGL-1，CD44 and CD54.

【Key words】 Ulcerative colitis； Wild Chrysanthemum； Serum adhesio lecules

First-authors address：Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.005

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是一種結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，病因尚不明確，病變范圍廣泛。目前大多認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與免疫因素、遺傳因素、心理因素、飲食因素等有關(guān)，其中免疫異常被認(rèn)為是最重要的發(fā)病因素。潰瘍性結(jié)腸炎治愈難度大、病程長，經(jīng)常反復(fù)發(fā)作，UC的發(fā)病率在我國呈升高的趨勢。目前UC臨床治療以激素、水楊酸制劑和免疫抑制劑為主，但療效欠佳，患者易產(chǎn)生耐藥性、過敏等不良反應(yīng)。中藥在治療UC上具有一定優(yōu)勢，避免了傳統(tǒng)西藥的弊端，在UC的治療上顯示出了廣闊前景，臨床上以中藥灌腸治療效果較好[1-2]。野茼蒿（Wild chrysanthemum）是菊科茼蒿屬一年或二年生草本植物，在我國境內(nèi)主要分布于廣東、海南、四川、云南等地，是一種常用的藥食兩用植物，含有多種類型化合物，可治療慢性腸胃炎[3-5]。黏附分子CD62P、CD44、CD54參與炎癥反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)，在UC的發(fā)病過程中起到了重要作用。本實驗用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）與乙醇混合液誘導(dǎo)UC大鼠模型，將野茼蒿應(yīng)用于UC大鼠，通過檢測其血清中相關(guān)黏附分子的變化水平，以期探討野茼蒿對UC的治療機(jī)制，為其藥用價值提供臨床依據(jù)，現(xiàn)報道如下。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔SD大鼠76只，體重（220±20）g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)中心，動物合格證號SCXK（黑）2013001。

1.2 藥品儀器與試劑 野茼蒿由課題組采集于組員四川家鄉(xiāng)荒坡，選取長勢良好的植株，采集后用自來水洗凈干燥。取干燥野茼蒿1 kg，加適量蒸餾水浸泡，再加10倍量蒸餾水，煮沸2.5 h，重復(fù)3次，合并水煎液過濾，減壓真空濃縮，冷凍干燥成凍干粉，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹6]。野茼蒿內(nèi)服成人用量約為0.85 g/kg（野茼蒿50 g，成人體重60 kg計算）。大鼠低中高劑量用量分別為1.7 g、3.4 g、6.8 g（按成人的2、4、8倍換算）。柳氮磺吡啶腸溶片（上海中西三維藥業(yè)有限公司，批號：31020450）成人每天用量為0.05 g/kg（SASP 3 g，成人體重60 kg計算），大鼠劑量0.2 g/kg（按成人4倍換算）[7]。5%TNBS（美國Sigma公司，批號：109K5008）；10%水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20130314）；大鼠CD62p、PSGL-1、CD44、CD54ELISA檢測試劑盒（上海邦亦生物科技有限公司，批號：DRE20542；北京安必奇生物科技有限公司，批號：DEIA6210；上海酶聯(lián)生物公司，批號：ml003353；上海酶聯(lián)生物公司，批號：ml202830）；無水乙醇、蒸餾水、苦味酸。流式細(xì)胞儀（CytomicFC500型，Beckman Coulter公司）；加樣槍、動物手術(shù)器械。

1.3 方法

1.3.1 造模 76只大鼠隨機(jī)選取12只作為空白對照組，64只作為造模組。全部大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)72 h。恒溫25 ℃標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，食用固體飼料，自由飲水，8 h通風(fēng)換氣一次，墊料24 h更換一次。造模組大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉（0.25 mL/100 g）后，用TNBS/乙醇溶液（100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 mL）溶液灌腸[8]，灌腸時灌腸針輕注入大鼠距離肛門7～8 cm的腸腔內(nèi)，灌腸后讓其自然蘇醒，注意保暖。對照組大鼠不做處理。

1.3.2 分組 造模后觀察，3 d內(nèi)死亡2只，再隨機(jī)處死兩只大鼠，解剖取其結(jié)腸觀察其結(jié)腸組織，確認(rèn)UC模型建立。剩下的60只大鼠隨機(jī)平均分為模型組、野茼蒿低、中、高劑量組、陽性對照組（SASP組），每組12只，每組用苦味酸對大鼠編號為1～12。

1.3.3 給藥 空白對照組2 mL生理鹽水灌胃；野茼蒿低、中、高劑量組分別給予對應(yīng)濃度的野茼蒿凍干粉解于2 mL蒸餾水溶液灌胃；陽性對照組等量柳氮磺吡啶用蒸餾水配置成200 mL的溶液灌胃，連續(xù)灌胃21 d。大鼠灌胃時將灌胃針沿左右嘴角插入大鼠嘴內(nèi)，注意讓針與大鼠食道成平行線，確認(rèn)灌胃針插入大鼠胃內(nèi)時再注入藥物。

1.3.4 標(biāo)本獲取 于末次給藥后禁食不禁水24 h，10%水合氯醛麻醉大鼠后，將大鼠迅速剖腹，取其下腔靜脈血，約5 mL，離心后取血清。沿其肛門向上解剖，取其距離肛門以上2～10 cm段的結(jié)腸，沿腸系膜緣剪開展平，將結(jié)腸組織置于4 ℃無菌生理鹽水中清洗片刻，去除腸腔內(nèi)的殘余糞便。

1.4 觀察指標(biāo) 對所取結(jié)腸標(biāo)本進(jìn)行腸黏膜損傷評分（CMDI）及組織病理學(xué)評分（HS）[9-10]；用ELISA法檢測血清中黏附分子，檢測方法參照ELISA檢測試劑盒，操作并記錄結(jié)果。對比分析各組大鼠CMDI評分及HS評分以及血清中上述黏附分子的含量的差異。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腸黏膜損傷評分及組織病理學(xué)評分比較 與空白對照組比較，模型組大鼠CMDI和HS評明顯升高（P<0.01或P<0.05）。與模型組比較，野茼蒿三組的CMDI和HS評分均明顯降低（P<0.01或P<0.05）；與SASP組相比，高劑量組的CMDI和HS評分較高（P<0.05），見表1。

2.2 各組血清相關(guān)黏附分子含量比較 與空白對照組比較，模型組大鼠黏附分子水平明顯升高（P<0.01或P<0.05）；與模型組比較，野茼蒿三組的黏附分子水平均明顯降低（P<0.01或P<0.05）；與SASP組相比，高劑量組的黏附分子水平較高（P<0.05），見表2。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因尚不明確的炎癥性疾病，治愈難度大。目前西藥治療副作用較大，療效欠佳，中藥對在對UC的治療上顯示出了廣闊的前景。

P選擇素（P-selectin，CD62p）存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞及血小板，在炎癥、血栓形成中起著重要作用。其高親和力的配體是P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein and 1，PSGL-1）。PSGL-1與CD62p的相互作用對炎癥發(fā)生等生理病理過程有重要作用[11]。研究表明，CD62p在UC中表達(dá)明顯上調(diào)，且CD62p單抗的抗黏附治療對潰瘍性結(jié)腸炎具有治療作用[12-13]。血漿中CD62p及其配體的水平可能成為判斷UC嚴(yán)重程度以及臨床診斷簡單易行的外周生物學(xué)指標(biāo)[14-15]。CD44是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，在脊椎動物體內(nèi)廣泛表達(dá)[16]。CD44介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與毛細(xì)血管網(wǎng)小靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，使淋巴細(xì)胞穿過血管內(nèi)壁，參與炎癥反應(yīng)。重度UC患者組織及血液中CD44表達(dá)較對照組增高，緩解期顯著下降[17-18]。CD54是免疫球蛋白超家族成員，可增強白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附作用，從而促進(jìn)炎性細(xì)胞滲出血管達(dá)到炎癥部位。UC重度患者血漿中CD54表達(dá)高于輕度組，輕度組的表達(dá)高于緩解組及健康組[19]。炎癥反應(yīng)時，活化的內(nèi)皮細(xì)胞釋放P選擇素，同時活化的白細(xì)胞表面表達(dá)P選擇素的配體PSGL-1，通過CD62p和PSGL-1的相互黏附，建立白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間聯(lián)系，也作為信號受體向白細(xì)胞內(nèi)傳遞活化信號，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[11，20]。CD44介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與毛細(xì)血管網(wǎng)小靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，使淋巴細(xì)胞穿過血管內(nèi)壁，參與炎癥反應(yīng)。CD54可增強白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附作用，從而促進(jìn)炎性細(xì)胞滲出血管達(dá)到炎癥部位[11，15，17]。endprint

本實驗將野茼蒿應(yīng)用于UC大鼠，取血檢測其血清中相關(guān)黏附分子的變化水平，對大鼠結(jié)腸做CMDI和HS評分，通過各組間對比，得出結(jié)論。實驗結(jié)果顯示，對比空白對照組，模型組大鼠血清中上述四種黏附分子均不同程度升高（P<0.01或P<0.05）；對比模型組，野茼蒿凍干粉的低中高劑量組大鼠血清中上述黏附分子水平不同程度降低（P<0.01或P<0.05），且野茼蒿劑量與黏附分子的含量呈負(fù)相關(guān)。CMDI評分以及HS評分結(jié)果顯示，對比空白對照組，模型組大鼠的兩個評分明顯升高（P<0.01或P<0.05）。對比模型組，野茼蒿凍干粉的低中高劑量組大鼠的兩個評分均有一定程度下降（P<0.01或P<0.05），野茼蒿劑量與黏附分子的含量呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，野茼蒿在一定程度上可以降低UC大鼠血清中CD62p、PSGL-1、CD44、CD54的水平，對U有一定程度的的緩解作用。作為一種藥食兩用類植物，相比于傳統(tǒng)西藥更加溫和，未來可能將野茼蒿投入到臨床使用，作為口服或灌腸中藥，輔助治療潰瘍性結(jié)腸炎。

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（收稿日期：2017-05-08） （本文編輯：鄧朝陽）endprint