甘草酸對膿毒癥小鼠模型腎臟的保護作用

葉菁菁

【摘要】 目的：探討甘草酸對膿毒癥小鼠模型的腎臟保護作用。方法：選取150只小鼠隨機分為5組：手術+安慰劑組，手術+高劑量藥物組，手術+中劑量藥物組，手術+低劑量藥物組，假手術+安慰劑組，每組各30只。干預4 h后使用半定量方式比較各組小鼠腎臟組織病理切片中腎小管損傷情況。結果：各組評分手術+安慰劑組>手術+低劑量藥物組>手術+中劑量藥物組>手術+高劑量藥物組>假手術+安慰劑組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：甘草酸能在一定程度上減輕膿毒癥小鼠的腎損害。

【關鍵詞】 膿毒癥； 急性腎損傷； 甘草酸

【Abstract】 Objective：To investigate the renal protective effect of glycyrrhizin on sepsis in mice.Method：150 mice were randomly divided into 5 groups：operation+placebo group，operation+high dose group；operation+medium dose group，operation+low dose group，sham operation+placebo group，30 cases in each group.After the intervention 4 h，the injury of renal tubules in pathological sections of mice in each group was compared by semi quantitative method.Result：All groups scored：sepsis+placebo group>sepsis+low dose group>sepsis+medium dose group>sepsis+high dose group>sham operation+placebo group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Glycyrrhizin can alleviate renal damage in sepsis mice to some extent.

【Key words】 Sepsis； Acute kidney injury； Glycyrrhizic Acid

First-authors address：The First Affiliated Hospital Fuzhou City of Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.004

甘草酸（Glycyrrhizic Acid，GA）是從傳統中藥甘草根部提取出來的主要活性成分，是一種三萜類化合物。甘草酸除了長期以來被使用在糖果生產和化妝品生產工業上之外，還是一種使用范圍極廣的中藥[1]。甘草酸體外實驗發現對T淋巴細胞活化具有調節作用，對γ干擾素有誘導作用，活化NK細胞，促進胸腺外T淋巴細胞分化。目前臨床多是應用于慢性肝病、改善肝功能異常，治療濕疹、皮膚炎、蕁麻疹等疾病。本實驗以盲腸結扎穿刺法造膿毒癥小鼠模型，觀察復方甘草酸苷注射液對膿毒癥小鼠腎臟的保護作用，為甘草酸的臨床適應證范圍提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物及飼養條件 清潔級8周齡BALB/C雄性小鼠150只，體重（21±1）g，雄性，由福建醫科大學動物實驗中心提供。動物實驗室溫度23 ℃，相對濕度40%～60%，白/夜循環為12/12 h。

1.1 實驗藥物及試劑 復方甘草酸苷注射液（日本米諾發源制藥株式會社座間工廠生產廠家，國藥準字J20130071）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、模型制備及給藥 雄性BALB/C小鼠150只，隨機分為5組，手術組+安慰劑組、手術組+高劑量藥物組、手術組+中劑量藥物組、手術組+低劑量藥物組、假手術組+安慰劑組，每組30只。手術組采用盲腸結扎穿刺法造模，假手術組同樣開腹，但是盲腸不結扎不穿刺納回腹腔再縫合腹壁。將藥品說明書中動物實驗提供的半數致死量作為參考數據，選取半數致死量的1/8、1/16、1/32分別為高劑量、中劑量、低劑量。造模后立即給予腹腔注射等體積的復方甘草酸苷注射液或生理鹽水進行干預，手術組+安慰劑組（生理鹽水），手術組+高劑量藥物組（25.9 mL/kg），手術組+中劑量藥物組（12.95 mL/kg），手術組+低劑量藥物組（6.475 mL/kg），假手術+安慰劑組（生理鹽水）。術后4 h，頸椎脫臼法處死小鼠。剝離完整腎臟組織，置于10%福爾馬林溶液中固定48 h。

1.2.2 觀察小鼠一般狀態 術后觀察小鼠精神狀態、行為、毛發、飲食情況等，并記錄。

1.2.3 腎臟組織病理學觀察 10%福爾馬林固定的腎臟組織制備石蠟切片，每只大鼠制備3張切片，HE染色，光鏡下觀察腎臟組織腎小管上皮細胞的病理改變。

1.3 評分標準 混濁、腫脹、壞死的腎小管上皮細胞為陽性細胞，陽性細胞百分比：在光鏡下（×400）10個視野計數，每個視野計數100個細胞的陽性細胞平均數。評分標準為：無陽性細胞為0分，陽性細胞百分比≤25%為1分，陽性細胞百分比26%～50%為2分，陽性細胞百分比51%～75%為3分，陽性細胞百分比≥76%為4分。

1.4 統計學處理 使用PEMS 3.1統計軟件進行處理，采用非參數秩和檢驗，兩兩比較用秩變換后進行方差分析，計數資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。endprint

2 結果

2.1 小鼠一般狀態觀察結果 假手術+安慰劑組小鼠手術麻醉復蘇后，精神狀態如常，正常進食進水。手術組的小鼠麻醉復蘇后，出現精神萎靡、立毛、懶動，不喜進食進水。

2.2 病理組織學光鏡下觀察結果 肉眼觀察假手術組小鼠腎臟組織表面光滑，呈現鮮紅色，質地柔軟。手術組小鼠腎臟組織較假手術組稍大，顏色稍蒼白、暗淡。光鏡下觀察，無論是否進行了盲腸結扎穿刺的小鼠，腎小管上皮細胞均出現了不同程度的腫脹、壞死，見圖1。手術組小鼠的腎臟組織中，腎小管上皮細胞出現廣泛的混濁、腫脹、壞死，見圖2。經過復方甘草酸苷注射液干預的手術組小鼠腎小管上皮細胞的病變范圍有所減輕，見圖3。

2.3 病理組織結果 兩兩比較顯示評分手術+安慰劑組>手術+低劑量藥物組>手術+中劑量藥物組>手術+高劑量藥物組>假手術+安慰劑藥物組，不同組間的評分比較差異有統計學意義，見表1。其中4分檔次組中以手術+安慰劑組樣本數最多，其次為手術+低劑量藥組；3分檔次組中手術+高劑量藥組樣本數最多，其次為手術+中劑量組；在2分檔次組中手術+高劑量藥組樣本數最多，其次是手術+高劑量藥組；1分檔次組中只有假手術+安慰劑組樣本，見圖4。值得注意的是，在2分及1分檔次組中均缺如手術+安慰劑組的樣本。并且1分檔次組中均無手術組的樣本。與之相對應的是，假手術+安慰劑組的樣本在4分及3分檔次組中也出現了缺如，見圖5。

3 討論

膿毒癥（sepsis）是一個古老的醫學話題，關于膿毒癥的治療更是一個古老的課題。隨著全球人口老齡化的不斷進展，腫瘤發病率年年攀升；醫學進步后帶來侵入性醫療操作的增加，使得膿毒癥發病率逐年攀升[2]。目前膿毒癥3.0將膿毒癥定義為宿主對感染的反應性失調，產生危及生命的器官功能損害[3]。既往研究發現，膿毒血癥的病死率與感染病原體的相關性不大，但與患者的炎癥反應具有重要的相關性[4]。在膿毒癥導致的器官功能損害中，首當其沖的臟器就是腎臟。有學者對歐美多個ICU的重癥患者進行調查發現，膿毒癥導致急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）的發病率超過50%，且合并了AKI的膿毒癥患者死亡率明顯高于未合并AKI的膿毒癥患者，高達30%～60%。故目前將膿毒癥是否合并AKI看做是膿毒癥患者死亡的獨立危險因素[5-6]。隨著對膿毒癥致AKI發病機制的深入研究，目前認為膿毒癥致AKI發生受多因素影響，包括炎性瀑布樣反應直接損傷[7]，腎內皮細胞損傷，微血栓形成[8-9]，腎臟血流動力學的改變[10]，免疫功能障礙[11]，腎臟細胞凋亡等。膿毒癥致AKI是一個連續性的發病過程，在早期以腎血流再分布異常導致的相對灌注不足以及能量代謝利用障礙為主，表現為細胞腫脹、代謝障礙；其后以腎臟炎癥反應和細胞凋亡為主要表現，提示腎臟細胞凋亡可能在膿毒癥致AKI中起著關鍵性作用[12]。AKI炎癥理論認為含毒素血液的超濾是腎小管應激繼而損害的引發機制[13]；膿毒癥時血中富含的中小分子物質（細胞因子、趨化因子、補體片段、其他類似物）在超濾液中濃聚并作用于腎小管腔表面對腎小管上皮細胞產生毒性作用。而機體免疫系統在致病微生物作用下會釋放出眾多的細胞因子，包括早期炎癥因子IL-1β、TNF-α等，以及一些晚期炎癥因子，如高遷移率族蛋白B1等。尤其是晚期炎癥因子，這些炎癥因子的產生明顯晚于早期炎癥因子，但是持續時間較長，并可通過多種途徑形成正反饋調節，將炎癥因子的產生釋放級聯放大，導致全身過度炎癥反應，進而造成臟器損傷[14]。

甘草酸是從甘草根部提取出來的有效活性成分，國內外許多學者對其免疫作用進行過研究。主要有效成分具有抗缺氧、抗局部缺血及抗炎等藥理作用，目前多用于肝病治療[15]，張偉等[16]研究發現甘草酸二銨對百草枯中毒大鼠具有腎臟保護作用。有學者使用RAW264.7細胞（BALB/c小鼠的巨噬細胞）研究甘草酸的抗炎作用機制，證明了甘草酸是通過PI3K/Akt/GSK3β途徑減少LPS誘導的巨噬細胞中IL-1和TNF炎癥基因表達，進而使得IL-1β和TNF-α濃度下降。國外還有文獻報道甘草酸是HMGB1的功能性抑制劑，它可以直接和HMGB1結合，阻斷HMGB1和蛋白激酶C之間的相互作用，抑制HMGB1的磷酸化。HMGB1磷酸化是HMGB1分泌的第一步，能阻止HMGB1從細胞核到細胞質的轉運，阻斷HMGB1和炎癥因子的正反饋[17]。本實驗中手術+甘草酸治療組的膿毒癥小鼠腎臟病理切片中腎臟的損傷程度較手術+安慰劑組膿毒癥小鼠腎臟損傷的程度輕，且呈明顯的劑量依耐性。甘草酸能夠通過PI3K/Akt/GSK3β途徑[18]和HMGB1/HMGB1受體（TLR4和RAGE）/NF-κB信號通路減少早期和晚期炎癥因子的分泌，打斷炎癥因子的正反饋，調節膿毒癥相關過度炎癥反應，從而發揮對腎臟的保護作用[19]。臨床國內學者張瓊華等[20]也觀察到甘草酸二銨注射液能夠降低膿毒癥AKI患者血清TLR4水平，并改善患者腎功能。

在本實驗中筆者發現無論是否接受了盲腸結扎穿刺手術，只要是接受了麻醉和腹部切開應激的小鼠，腎臟均出現了不同程度的急性腎損傷的病理表現。其中4分檔次組中以手術+安慰劑組樣本數最多，其次為手術+低劑量藥組；3分檔次組中手術+高劑量藥組樣本數最多，其次為手術+中劑量組；在2分檔次組中手術+高劑量藥組樣本數最多，其次是手術+高劑量藥組；1分檔次組中只有假手術+安慰劑組樣本。在2分及1分檔次組中均缺如手術+安慰劑組的樣本，并且1分檔次組中均無手術組的樣本。與之相對應的是，假手術+安慰劑組的樣本在4分及3分檔次組中也出現了缺如。其中假手術組的小鼠腎臟組織中腎小管損傷的程度較為輕微，考慮其損傷與麻醉、手術應激引起的無菌性炎癥有關。而施行了盲腸結扎穿刺手術的小鼠，無論是否接受干預治療，腎臟的細胞水腫均較為嚴重。尤其是手術后僅使用了安慰劑的小鼠，評分為4～3分，4分比例也是最多的。手術后使用藥物干預的小鼠，腎臟得到了有效的保護，評分較手術+安慰劑組明顯降低，但該實驗中并未觀察到腎小管壞死現象，這可能與觀察時間為膿毒血癥早期有關。本實驗發現甘草酸可減輕對膿毒癥小鼠發生AKI的程度，尤其是在高劑量組，提示其可在早期膿毒癥腎臟保護方面發揮作用，且呈明顯的劑量依賴性，但其具體機制及其臨床實用劑量需進一步的研究。endprint

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（收稿日期：2017-07-14） （本文編輯：周亞杰）endprint