miR-16在葡萄膜黑色素瘤細胞中的表達變化及其對細胞增殖的影響

王芳，余愛華

(武漢大學中南醫院，武漢430000)

miR-16在葡萄膜黑色素瘤細胞中的表達變化及其對細胞增殖的影響

王芳，余愛華

(武漢大學中南醫院，武漢430000)

目的觀察miR-16在葡萄膜黑色素瘤細胞中的表達變化，及其對細胞增殖的影響。方法培養葡萄膜黑色素瘤細胞系SP6.5及正常葡萄膜黑色素細胞系UM-U-95。采用實時定量PCR法檢測SP6.5細胞、UM-U-95細胞中的miR-16。將SP6.5細胞分為miR-16組、對照組和miR-16抑制劑組。其中miR-16組轉染miR-16 mimics，對照組轉染scramble(陰性對照序列)，miR-16抑制劑組轉染miR-16抑制劑。分別于轉染24、48、72 h采用MTT法測算各組相對活細胞百分比；轉染72 h后采用克隆形成實驗測算克隆形成率；轉染72h后，采用Western blotting法檢測各組細胞中的成纖維細胞生長因子2(FGF2)蛋白。結果SP6.5細胞、UM-U-95細胞中miR-16相對表達量分別為0.22±0.02、1.0，SP6.5細胞中miR-16的相對表達量低于UM-U-95細胞(P<0.01)。轉染后48、72 h miR-16組相對活細胞百分比低于對照組，miR-16抑制劑組相對活細胞百分比高于對照組(P均<0.05)。轉染72 h后，miR-16組、對照組、miR-16抑制劑組克隆形成率分別為20.15%±2.53%、42.63%±4.42%、68.36%±6.25%，miR-16組克隆形成率低于對照組，miR-16抑制劑組克隆形成率高于對照組(P均<0.05)。miR-16組、對照組、miR-16抑制劑組細胞中FGF2蛋白相對表達量分別為0.27±0.02、1.0、5.64±0.58，miR-16組FGF2蛋白相對表達量低于對照組，miR-16抑制劑組FGF2蛋白相對表達量高于對照組(P均<0.05)。結論miR-16在葡萄膜黑色素瘤細胞中表達下調。miR-16過表達可抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、降低克隆形成率，抑制miR-16表達可增強葡萄膜黑色素瘤細胞的增殖能力。miR-16對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖能力的影響可能與調節FGF2蛋白表達有關。

微小RNA16；葡萄膜黑色素瘤；細胞增殖；成纖維細胞生長因子2

葡萄膜黑色素瘤是成人常見的原發性眼內惡性腫瘤，起源于葡萄膜黑色素細胞，發病率為0.02%～0.06%，易發生轉移[1]。據報道，葡萄膜黑色素瘤患者5年病死率為17%～50%。腫瘤常發生肝臟轉移，一旦發生肝臟轉移則預后極差，生存期僅2～7個月，僅13%的患者存活超過1年[2]。深入研究葡萄膜黑色素瘤的發病機制對提高該病診治水平和新藥研發具有重要意義。miRNA是一類非編碼長鏈RNA，可在后轉錄水平下調靶基因的表達。miR-16被認為是一種抑癌基因[3]，其在多種腫瘤中異常表達[4,5]，并參與細胞增殖、凋亡等生物學過程。然而miR-16在葡萄膜黑色素瘤細胞中的表達變化及其對細胞增殖的影響尚未見報道。為此，2014年3月～2017年1月，我們進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 葡萄膜黑色素瘤細胞系SP6.5及正常葡萄膜黑色素細胞系UM-U-95購自武漢大學醫學院實驗中心。TRIzol購自Invitrogen公司。miR-16 mimics、scramble及抑制劑均由廣州銳博生物科技公司合成。

1.2 SP6.5細胞、UM-U-95細胞中miR-16檢測 采用實時熒光定量PCR法，按照TRIzol試劑說明書，從SP6.5細胞、UM-U-95細胞中提取總RNA。取5 ng的總RNA逆轉錄合成cDNA。在ABI7500實時定量PCR儀中進行PCR反應。以U6小核RNA作為內參。以2-ΔΔCt表示miR-16的相對表達量。

1.3 轉染miR-16 mimics、miR-16抑制劑后SP6.5細胞增殖觀察

1.3.1 細胞分組與處理 將SP6.5細胞、UM-U-95細胞加入RPMI1640培養基，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。將SP6.5細胞分為miR-16組、對照組和miR-16抑制劑組。其中miR-16組轉染miR-16 mimics，對照組轉染scramble(陰性序列對照)，miR-16抑制劑組轉染miR-16抑制劑。轉染試劑為Lipofectamine2000。轉染后繼續培養24 h進行后續實驗。

1.3.2 相對活細胞百分比測算 采用MTT法。各組SP6.5細胞以1×104/孔接種于12孔板中，培養24 h后添加5 mg/mL的MTT溶液40 μL，孵育4 h后每孔加入200 μL的DMSO，搖床上充分震蕩。在490 nm波長測定光密度值(OD值)。相對活細胞百分比=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.3 細胞克隆形成率測算 將各組SP6.5細胞以1×103/孔接種于12孔板中，培養72 h后去除培養液，用PBS清洗3遍，用甲醇固定細胞20 min，1%亞甲基藍染色40 min，去離子水清洗兩遍，晾干。顯微鏡下計算大于50個細胞的克隆數量，實驗重復3次，取平均值。克隆形成率(PE)=(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.3.4 細胞中成纖維細胞生長因子2(FGF2)蛋白檢測 采用Western blotting法。轉染72 h后收集三組細胞，加入裂解液提取細胞總蛋白，以每孔30 μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h；常規濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；分別加入FGF2一抗(1∶200)和GAPDH一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜；加入二抗羊抗兔(1∶1 000)37 ℃ 2 h，PBS漂洗3次；ECL液發光，凝膠成像系統顯影；用Quantity One 1-D分析軟件分析蛋白印跡條帶的灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

2 結果

2.1 SP6.5細胞、UM-U-95細胞中miR-16表達比較 SP6.5細胞、UM-U-95細胞中miR-16相對表達量分別為0.22±0.02、1.0，SP6.5細胞中miR-16的相對表達量低于UM-U-95細胞(P<0.01)。

2.2 轉染miR-16 mimics、miR-16抑制劑后SP6.5細胞增殖變化 轉染后48、72 h miR-16組相對活細胞百分比低于對照組，miR-16抑制劑組相對活細胞百分比高于對照組(P均<0.05)。見表1。轉染72 h后，miR-16組、對照組、miR-16抑制劑組克隆形成率分別為20.15%±2.53%、42.63%±4.42%、68.36%±6.25%，miR-16組克隆形成率低于對照組，miR-16抑制劑組克隆形成率高于對照組(P均<0.05)。miR-16組、對照組、miR-16抑制劑組細胞中FGF2蛋白相對表達量分別為0.27±0.02、1.0、5.64±0.58，miR-16組FGF2蛋白相對表達量低于對照組，miR-16抑制劑組FGF2蛋白相對表達量高于對照組(P均<0.05)。

表1 三組SP6.5細胞相對活細胞百分比的比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

葡萄膜黑色素瘤是成年人常見的眼內惡性腫瘤，起源于葡萄膜黑色素細胞，好發于白種人，白種人發病率為黑種人的8.5倍[6]。按改良Callender分型系統，葡萄膜黑色素瘤病理分型可分為梭形細胞型、類上皮細胞型、混合細胞型和其他類型[2]。葡萄膜黑色素瘤生長方式包括內生長、外生長及扁平彌散生長。腫瘤直徑、病理分型都是葡萄膜黑色素瘤患者預后的重要影響因素[7]。手術仍是該病的最有效治療方法之一，但患者5年生存率仍不樂觀。據Foulds等[8]報道，腫瘤直徑<15.0 mm的葡萄膜黑色素瘤患者5年生存率達88.4%；而對于直徑≥16.0 mm者，5年生存率僅為43%。

現代腫瘤學研究認為，腫瘤的發生發展是一系列分子或信號通路功能突變的結果。miRNA是腫瘤學研究的熱點。迄今共發現與人類相關的miRNA共約1 000多種，可與不同的靶標mRNA結合而調控約30%的人類基因表達[9]。miRNA被報道在多種腫瘤中異常表達，參與腫瘤的發生發展。miR-16位于13q14.3基因[10]，在非小細胞肺癌[5]、卵巢癌[11]、前列腺癌[12]、大腸癌[13]中表達下調。汪旭東等[5]報道miR-16在人肺腺癌細胞系A549中低表達，過表達miR-16可抑制肺癌細胞增殖并促進其凋亡，誘導G1/S期阻滯。馬群英等[13]發現miR-16可抑制大腸癌細胞增殖，誘導G0/G1期阻滯，下調CyclinD1和CDK6蛋白表達。張騰龍等[14]研究表明miR-16在多發性骨髓瘤中低表達，其低表達與患者病程和分期相關，可作為判斷患者預后的指標之一。本研究結果顯示，葡萄膜黑色素瘤細胞系SP6.5中的miR-16表達水平為正常葡萄膜黑色素細胞UM-U-95的0.22±0.02倍，呈低表達。miR-16過表達后，miR-16組相對活細胞百分比和克隆形成率低于對照組；反之，miR-16抑制劑組相對活細胞百分比和克隆形成率均高于對照組。上述結果提示miR-16在黑色素瘤細胞中呈低表達，且miR-16高表達可抑制細胞增殖能力，這與相關報道結果一致[5,13，14]。

FGF2是成纖維細胞生長因子家族成員之一，可調控細胞生長、分化、血管生成并刺激皮膚傷口愈合。研究表明，FGF2在多種腫瘤中高表達，包括前列腺癌[15]、結腸癌[16]、肺癌[17]、膀胱癌[18]、乳腺癌[19]及食管癌[20]等。FGF2過表達與食管癌術后復發和預后差有關，且FGF2可通過調控PI3K/AKt信號通路功能，促進食管癌細胞系ECA109增殖、遷移和侵襲[20]。本研究發現，miR-16組FGF2蛋白相對表達量低于對照組，miR-16抑制劑組FGF2蛋白相對表達量高于對照組，提示miR-16抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖能力的作用機制可能與下調FGF2蛋白表達有關。

總之，miR-16在葡萄膜黑色素瘤細胞中表達下調，miR-16過表達可抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、降低克隆形成率，抑制miR-16表達可增強葡萄膜黑色素瘤細胞的增殖能力。我們推測miR-16對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖能力的影響與調節FGF2蛋白表達有關。上述研究結果為葡萄膜黑色素瘤的治療提供了新的研究方向。miR-16有可能成為葡萄膜黑色素瘤治療的新靶點。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.011

R739.7

A

1002-266X(2017)39-0039-03

余愛華(E-mail: aihua929819@163.com)

2017-05-27)