S-烯丙基巰基半胱氨酸對乳腺癌細胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用及其機制

閆金銀，張曉云，李寧，王鹿，張揚，蔡海峰

(華北理工大學附屬唐山市人民醫(yī)院，河北唐山063000)

S-烯丙基巰基半胱氨酸對乳腺癌細胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用及其機制

閆金銀，張曉云，李寧，王鹿，張揚，蔡海峰

(華北理工大學附屬唐山市人民醫(yī)院，河北唐山063000)

目的觀察S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)對乳腺癌細胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用，并探討其作用機制。方法將MCF-7細胞懸液接種于BALB/C雌性裸鼠右側腋下近上肢處成瘤，制作乳腺癌MCF-7細胞裸鼠皮下移植瘤模型。將造模成功的裸鼠隨機分為對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組。對照組給予Nacl注射液，低劑量SAMC組給予150 mg/kg的SAMC，高劑量SAMC組給予300 mg/kg的SAMC，紫杉醇組給予10 mg/kg的紫杉醇。每周腹腔注射給藥3次，共給藥3周。末次給藥后第2天處死裸鼠，取移植瘤組織稱重，計算各組腫瘤抑瘤率；HE染色鏡下觀察腫瘤組織病理變化；采用免疫組化法檢測各組腫瘤組織中的VEGF、Caspase-3蛋白。結果低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組瘤重低于對照組(P均<0.05)。高劑量SAMC組腫瘤抑制率高于低劑量SAMC組(P<0.05)，但與紫杉醇組相比差異無統(tǒng)計學意義。腫瘤組織HE染色見低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組出現(xiàn)不同程度的細胞壞死，三組壞死面積和程度依次增大。對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組腫瘤組織中Caspase-3蛋白相對表達量依次升高，VEGF相對表達量依次降低(P均<0.05)。結論SAMC可抑制乳腺癌細胞裸鼠移植瘤的生長，機制可能與Caspase-3蛋白表達上調、VEGF蛋白表達下調有關。

S-烯丙基巰基半胱氨酸；乳腺癌；血管內皮生長因子；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3

乳腺癌是臨床最常見女性惡性腫瘤。流行病學研究[1，2]表明，乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，并且發(fā)病年齡趨于年輕化，預計到2030年，乳腺癌發(fā)病人數(shù)將達264萬，病死人數(shù)達170萬[3]。近年越來越多的研究表明，許多傳統(tǒng)中藥不僅具有明顯抗腫瘤療效，且毒性作用小，抗腫瘤的同時可提高機體免疫力。大蒜富含機體所需的多種微量元素及生物活性成分。S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)是大蒜水溶性有效活性成分之一，現(xiàn)已證實SAMC對結腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌及白血病等許多惡性腫瘤細胞的增殖有抑制作用[4～6]，然而在動物體內實驗觀察SAMC對乳腺癌作用的相關研究較少。紫杉醇可抑制細胞有絲分裂過程中紡錘體的形成，使腫瘤細胞有絲分裂過程停滯，誘導細胞凋亡，目前已成為乳腺癌患者最常使用的化療藥物之一[7～9]。本研究建立了乳腺癌細胞裸鼠移植瘤模型，以紫杉醇為陽性對照，觀察SAMC的抑瘤作用，并探討可能的作用機制，為SAMC應用于乳腺癌臨床治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 MCF-7乳腺癌細胞系(百恩維生物科技有限公司)，4周齡BALB/C雌性裸鼠(北京維通利華公司)，SAMC(北京世紀奧科生物技術有限公司)，紫杉醇注射液(深圳萬樂制藥有限公司)，DAB顯色試劑(上海生工生物工程股份有限公司)，VEGF、Caspase-3免疫組化試劑盒(北京中杉金橋有限公司)。

1.2 乳腺癌細胞裸鼠移植瘤模型建立 MCF-7細胞接種于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清、100 U/mL的鏈霉素、100 U/mL的青霉素)，在37 ℃、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞用胰酶消化，離心，制成細胞懸液，將含1×107個細胞的懸液200 μL接種于裸鼠右側腋下近上肢處成瘤。造模成功標準為裸鼠移植瘤長徑≥5 mm。

1.3 實驗分組與SAMC用法 將造模成功的24只裸鼠隨機分為對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組和紫杉醇組。對照組給予0.9% NaCl注射液，0.2 mL/次；低劑量SAMC組給予150 mg/kg的SAMC；高劑量SAMC組給予300 mg/kg的SAMC；紫杉醇組給予10 mg/kg的紫杉醇。各組每周腹腔注射3次，隔2 d注射1次，每次注射前稱重，共給藥3周。干預期間觀察裸鼠生長狀態(tài)。

1.4 瘤重測量及腫瘤抑制率測算 各組于末次給藥后第2天采用0.2%水合氯醛麻醉取瘤，脫頸法處死全部裸鼠。完整分離腫瘤組織，稱瘤重，計算各組腫瘤抑制率，腫瘤抑制率=(1-實驗組瘤重/對照組瘤重)×100%。

1.5 腫瘤組織病理觀察 將腫瘤組織蠟塊固定于切片機上進行切片，然后進行脫蠟及水化、蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色、脫水透明及封片，鏡下觀察各組切片中腫瘤組織病理變化，拍照。

1.6 腫瘤組織中VEGF、Caspase-3蛋白檢測 將石蠟包埋的腫瘤標本做4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟水化，微波修復抗原，3%H2O2室溫孵育7 min，阻斷內源性過氧化物酶，滴加10%山羊血清封閉，加1∶100稀釋的一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌后加二抗(辣根過氧化物酶標記)，DAB顯色2～4 min，蘇木素復染，樹脂封片，鏡下觀察拍照。圖片收集后用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件進行分析，以目的蛋白陽性表達區(qū)域的積分密度值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組瘤重和腫瘤抑制率比較 SAMC干預后裸鼠皮下移植瘤的生長速度減緩，并隨SAMC濃度的升高移植瘤生長速度受抑制越明顯。對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組瘤重分別為(3.05±0.26)、(2.36±0.18)、(2.09±0.14)、(1.92±0.16)g，低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組瘤重低于對照組(P均<0.05)。低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組抑瘤率分別為22.62%±0.28%、31.48%±0.23%、37.05%±0.12%，高劑量SAMC組腫瘤抑制率高于低劑量SAMC組(P<0.05)，但與紫杉醇組相比差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 各組腫瘤組織病理變化 對照組腫瘤組織細胞排列緊密，細胞體積增大形態(tài)不規(guī)則。低劑量SAMC組中組織細胞排列疏松，出現(xiàn)較為分散的小面積的細胞壞死。高劑量SAMC組出現(xiàn)較大面積的細胞壞死，細胞結構消失。紫杉醇組細胞壞死更為徹底，壞死區(qū)呈均質紅染。見圖1。

注：A為對照組；B為低劑量SAMC組；C為高劑量SAMC組；D為紫杉醇組。

圖1各組腫瘤組織病理變化(箭頭指示壞死區(qū))

2.3 各組腫瘤組織中Caspase-3、VEGF蛋白表達比較 鏡下觀察到Caspase-3蛋白表達于乳腺癌細胞的胞質及部分胞膜，陽性表達產(chǎn)物染色后呈現(xiàn)棕黃色(見圖2)。VEGF表達于乳腺癌細胞的胞質內，鏡下見棕黃色顆粒，呈團塊狀或片狀分布(見圖3)。對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組腫瘤組織中Caspase-3蛋白相對表達量分別為9 763±814、13 626±912、16 732±631、18 955±738，VEGF蛋白相對表達量分別為8 810±625、6 979±780、4 945±537、3 231±569。對照組、低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組腫瘤組織中Caspase-3蛋白相對表達量依次升高，VEGF相對表達量依次降低(P均<0.05)。

注：A為對照組；B為低劑量SAMC組；C為高劑量SAMC組；D為紫杉醇組。

圖2各組腫瘤組織Caspase-3蛋白表達情況

注：A為對照組；B為低劑量SAMC組；C為高劑量SAMC組；D為紫杉醇組。

圖3各組腫瘤組織中VEGF蛋白表達情況

3 討論

目前天然植物提取物以其抗腫瘤效果好、不良反應少等優(yōu)點成為抗惡性腫瘤藥物研究的熱點領域之一。大蒜中所含有的多種含硫化合物活性成分不僅可預防癌癥發(fā)生，還具有抗腫瘤作用。流行病學調查研究表明大蒜的攝入量與許多惡性腫瘤發(fā)病率呈反比[10]。SAMC作為大蒜主要活性成分之一，其抗腫瘤作用已得到廣泛證實。本實驗通過建立乳腺癌細胞裸鼠移植瘤模型，應用不同濃度劑量SAMC進行干預，觀察其體內抗腫瘤作用并探索可能的機制。本研究結果顯示，對照組瘤重高于其余三組，高劑量SAMC組腫瘤抑制率高于低劑量SAMC組，但與紫杉醇組相比差異無統(tǒng)計學意義；腫瘤組織HE染色見低劑量SAMC組、高劑量SAMC組、紫杉醇組出現(xiàn)不同程度的細胞壞死，三組壞死面積和程度依次增大。這初步證實了SAMC可顯著抑制乳腺癌裸鼠皮下移植瘤生長，提示SAMC在裸鼠體內可發(fā)揮抗腫瘤作用。

為進一步探討SAMC的抑瘤作用機制，我們采用免疫組化法檢測了腫瘤組織中的Caspase-3蛋白和VEGF蛋白。Caspase家族是一組半胱氨酸蛋白酶，特異性切割天冬氨酸，在細胞凋亡過程中有重要作用。目前研究[11，12]表明Caspase-3處于依賴Caspase家族級聯(lián)反應的3條凋亡信號傳導通路的關鍵環(huán)節(jié)，是最重要的細胞凋亡過程中的效應分子。本研究結果顯示低劑量SAMC組、高劑量SAMC組及紫杉醇組Caspase-3蛋白表達水平均高于對照組，且高劑量SAMC組高于低劑量SAMC組，但低于紫杉醇組，提示SAMC可提高乳腺癌組織中Caspase-3蛋白的表達水平，進而促進細胞凋亡的發(fā)生。同時，有研究表明SAMC可以通過上調p53、p21表達，誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，觸發(fā)線粒體凋亡途徑等機制誘導乳腺癌細胞凋亡[13]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的增殖、浸潤及遠處轉移特性均以有效血液供應為基礎[14]。新生小血管為腫瘤組織快速生長提供所需營養(yǎng)物質[15]。VEGF作用于血管內皮細胞，可強烈促進其有絲分裂，促使新血管形成，已被認為是促進惡性腫瘤血管生成的最強細胞因子[16，17]。研究表明，VEGF不僅可以促進內皮細胞增殖，增加血管通透性，還可上調Bcl-2基因表達，發(fā)揮抑制腫瘤細胞凋亡，從而間接起到促腫瘤細胞增殖及生長的作用[18，19]。近來相關研究提示VEGF可能參與了惡性腫瘤的演變過程，并且與乳腺癌惡性程度有一定的相關性[20]。本研究觀察了各組腫瘤組織中VEGF的表達變化，結果顯示低劑量SAMC組、高劑量SAMC組及紫杉醇組Caspase-3蛋白表達水平均低于對照組，高劑量SAMC組低于低劑量SAMC組，但高于紫杉醇組，提示SAMC可能通過下調乳腺癌組織中VEGF的表達，抑制組織內新血管的生成能力，使腫瘤組織營養(yǎng)供給不足，進而抑制其生長并促進組織壞死。

綜上所述，SAMC可抑制乳腺癌細胞裸鼠移植瘤的生長，機制可能與Caspase-3蛋白表達上調、VEGF蛋白表達下調有關。在接下來的研究中，我們將進一步深入探索SAMC抑制乳腺癌的相關分子機制，為研發(fā)新抗腫瘤藥物、探索抗腫瘤治療新靶點提供理論依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.010

R737.9

A

1002-266X(2017)39-0036-03

蔡海峰(E-mail: 13303050005@163.com)

2017-06-10)