32例套細胞淋巴瘤中BTK蛋白的表達及臨床意義*

賈曉輝 孔令喆 王先火 張會來

32例套細胞淋巴瘤中BTK蛋白的表達及臨床意義*

賈曉輝 孔令喆 王先火 張會來

目的：檢測套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）患者病理組織中Bruton酪氨酸激酶（Bruton tyrosin kinase，BTK）表達水平并分析其與患者臨床特征及預后的相關性。方法：選取天津醫科大學腫瘤醫院2011年1月至2015年12月期間經病理檢測診斷為MCL且隨訪資料完整的32例患者和10例良性淋巴結增生患者的病理組織。采用免疫組織化學法對32例MCL組織和10例良性淋巴結組織染色，并采用SPSS 17.0統計學軟件對所收集的患者臨床數據資料進行分析。結果：BTK蛋白在MCL組織和正常的淋巴組織中均呈陽性表達，但在MCL病理組織中多為強陽性表達；BTK陽性表達與Ki-67和MIPI評分相關；應用Kaplan-Meier法對預后進行分析，顯示BTK強陽性表達患者的無進展生存期（progression free survival，PFS）顯著低于BTK弱表達患者（P=0.030），但總生存期（overall survival，OS）無統計學意義（P=0.073）；PFS的單因素分析結果顯示，年齡≥65歲，ECOG評分≥2分，骨髓受累，BTK強陽性表達，Ki-67＞30%，根據套細胞淋巴瘤國際預后指數（mantle cell lymphoma international prognostic index，MIPI）評分≥6分，皆是MCL患者的不良預后因素，但在Cox多因素分析結果中僅MIPI評分≥6分可作為MCL患者的獨立不良預后因素。結論：BTK在MCL患者中多為強陽性表達，且與Ki-67和MIPI評分呈正相關；BTK強陽性表達患者的PFS顯著低于BTK弱表達患者，但由于隨訪時間短暫和樣本量限制，BTK的強陽性表達尚不能作為PFS的一項獨立不良預后因素。

Bruton酪氨酸激酶 套細胞淋巴瘤 無進展生存期 依魯替尼

套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）是B細胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL）中一種少見的特殊亞型，約占3%～10%［1］。主要的遺傳學特點是染色體t（11；14）（q13；q32）易位引起細胞周期蛋白D1（cell cycle protein D1，cyclin D1）過表達和部分轉錄因子SOX-11過表達［2］。MCL兼有惰性淋巴瘤和侵襲性淋巴瘤的兩種臨床特征［3］，發病中位年齡約為68歲，男女比例約為3∶1，患者確診時多為Ann Arbor分期Ⅲ期或Ⅳ期，并伴有外周血，消化道和骨髓等結外部位的受累，但也有部分患者臨床表現為惰性病程，在不接受治療的情況下，數年也未見明顯病程進展［4-5］，目前尚無標準統一的治療方案。

Bruton酪氨酸激酶（Bruton tyrosin kinase，BTK）是B細胞表面受體（B cell antigen receptor，BCR）信號通路中關鍵分子，細胞內BCR信號通路的激活可促進腫瘤的發生和發展［6-7］。BTK抑制劑依魯替尼（ibrutinib）可以選擇性結合BTK激酶結構域的變構抑制性區段中的半胱氨酸481殘基，通過抑制其在酪氨酸殘基223的自磷酸化而不可逆地消除BTK的完全活性［8］。目前，ibrutinib已被批準用于MCL、華氏巨球蛋白血癥（Waldenstrom's macroglobulinemia，WM）慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma，CLL/SLL）的臨床治療，顯著改善患者的預后［9-10］，但是作用靶點BTK是否可作為MCL患者的一項獨立預后指標還未做過系統評估。本研究檢測32例MCL患者病理組織中BTK的表達水平并分析了其相關的臨床特點和預后影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取天津醫科大學腫瘤醫院2011年1月至2015年12月經病理檢測診斷為MCL且隨訪資料完整的32患者和10例良性淋巴結增生的患者的病理組織。

1.1.2 試驗材料 完整石蠟組織均取自于天津醫科大學腫瘤醫院病理科，兔抗BTK單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，羊兔二抗購自上海Abmart公司，蘇木素細胞染色液、DAB顯色試劑盒、抗體稀釋液和檸檬酸鹽抗原修復液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 石蠟切片置在60℃恒溫箱中烘烤60 min后依次經二甲苯和不同濃度乙醇脫蠟水化，高壓熱修復暴露抗原決定簇，將抗原修復后的切片放入3%過氧化氫溶液中，室溫避光封閉20 min，在切片組織上滴加5%的動物血清封閉非特異性蛋白，滴加BTK抗體（1∶200濃度稀釋），4℃過夜孵育，室溫條件下滴加羊兔二抗37℃孵育40 min，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色后蘇木素復染聚丁二酸丁二醇酯［poly（butylenes succinate），PBS］返藍，依次經75%、95%、100%的乙醇脫水，室溫晾干后中性樹膠封片，觀察染色結果采集圖像。

1.2.2 免疫組織化學結果判定和分析 由兩位專業的淋巴瘤病理學醫生診斷并共同判定染色結果，BTK蛋白主要表達在細胞膜和細胞質中，光學顯微鏡下觀察到細胞膜或細胞質被染成棕黃色即為BTK蛋白陽性表達，在×400倍顯微鏡下，每張載玻片要觀察5個視野，計數所在視野中細胞總數和BTK蛋白陽性表達的細胞數，按陽性細胞所占的百分比計分：陽性細胞數≤10%為0分，25%～50%為1分，50%～75%為2分，＞75%為3分；顯色強度計分為：未著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；將兩項積分相乘，≥6分為高表達，＜6分為低表達。

1.2.3 隨訪 隨訪截止時間為2016年12月，中位隨訪時間為27個月，所有患者均獲得隨訪。預后評價指標為無進展生存期（progression free survival，PFS）是指患者確診時至疾病進展或復發的間隔時間。總生存期（overall survival，OS）是指患者確診時至患者死亡或隨訪終點截止的間隔時間。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。應用Fisher精確檢驗法分析BTK蛋白表達水平與患者臨床特征之間的關系。預后因素的單因素分析采用Kaplan-Meier法，差異應用Log-rank檢驗，多因素分析采用Cox風險比例模型方法。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 患者基本情況

32例MCL患者，其中男性23例，女性9例，中位年齡為61（42～75）歲，其中年齡≥65歲12例；臨床分期主要采用Ann Arbor分期法，Ⅰ～Ⅱ期3例，Ⅳ～Ⅳ期29例；細胞增值指數Ki-67＞30%為13例（40.6%），伴有骨髓受累者20例（62.5%），β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β 2-MG）＞3 mg/L為14例（43.7%），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）≥250 IU/L 16例（50.0%）；根據套細胞淋巴瘤國際預后指數（mantle cell lymphoma international prognostic index，MIPI）評分，MIPI 0～3分（低危組）15例，MIPI 4～5分（中危組）8例，MIPI 6～11分（高危組）9例，鑒于本研究病例樣本數量的限制和更好的預后差異分析，本研究將MIPI分為2個亞組，分別為MIPI＜6分（低中危組）23例（71.88%）和MIPI≥6分（高危組）9例（28.12%）。其中12例（37.5%）患者接受RCHOP方案（利妥昔單抗+環磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松）治療，8例（25.0%）患者接受CHOP樣方案治療，5例（15.6%）患者接受R-hyper-CVAD/MA方案（利妥昔單抗+環磷酰胺+長春新堿+多柔比星+地塞米松+甲氨蝶呤+阿糖胞苷）治療，4例（12.5%）患者接受hyper-CVAD/MA方案治療，2例（6.3%）患者接受利妥昔單抗、環磷酰胺和氟達拉濱聯合治療，1例患者（3.1%）接受利妥昔單抗和ibrutinib聯合治療。其中1例患者（3.1%）接受高劑量化療后行自體干細胞移植（autologous stem cell transplantation，ASCT）。

2.2 BTK在組織中的表達情況

免疫組織化學染色結果顯示，BTK在組織中的表達主要位于細胞質和細胞膜，為棕黃色著色。所有良性反應性淋巴結組織中，BTK陽性表達主要局限在生發中心外的套區，生發中心則呈弱陽性。但在MCL組織中BTK呈現不同程度的強陽性著色，根據染色評判標準，MCL中BTK高表達（≥6分）主要表現為組織廣泛彌漫性陽性著色并伴有生發中心的破壞和消失，而BTK低表達（＜6分）主要表現為局限于切片組織邊緣的強陽性著色（圖1）。

圖1 BTK蛋白在組織中的表達情況Figure 1 BTK expression in tissues

2.3 BTK表達的臨床特征和相關預后分析

MCL組織經過免疫組織化學染色和陽性評判標準，BTK高表達（≥6分）患者19例（59.4%），BTK低表達（＜6分）患者13例（40.6%），與MCL患者臨床特征的相關性分析結果顯示，BTK的陽性表達與患者的Ki-67（P=0.019）和MIPI評分（P=0.038）顯著相關，而與性別、年齡、臨床分期、B癥狀、骨髓受累、WBC、LDH和血清β2-MG差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。隨后BTK單因素預后分析結果發現，BTK高表達的患者PFS顯著低于BTK低表達患者（P=0.030），中位PFS（median progression free survival，mPFS）為14.5個月（95%CI：7.7～18.3個月），而BTK低表達患者mPFS為23.5個月（95%CI：15.4～33.7個月）；隨訪期間，BTK低表達組中有5例患者（38.5%）發生復發或疾病進展，而BTK高表達中有9例（47.4%）?；颊逴S的預后差異無統計學意義（P=0.073，圖2）。

2.4 患者PFS的預后分析

中位隨訪時間為27（2～68）個月，32例患者中，接受2個療程化療后達完全緩解（complete remission，CR）為5例（15.6%），15例（46.9%）為部分緩解（partial remission，PR），總有效率（CR+PR）為62.5%，但因患者例數較少，治療方案不統一，未行統計學分析。部分臨床特征、生物學指標的PFS單因素分析結果顯示，年齡≥65歲、ECOG為2～4分、骨髓受累、BTK高表達，Ki-67＞30%和MIPI≥6分均為患者的不良預后因素，但在Cox多因素分析模型中，僅MIPI≥6分為PFS獨立不良預后因素（P=0.045），BTK尚不能作為MCL患者的獨立預后因素（P=0.988，表2）。

表1 MCL患者的基本臨床特征Table 1 Baseline characteristics of patients with MCL

表1 MCL患者的基本臨床特征（續表1）Table 1 Baseline characteristics of patients with MCL

圖2 MCL患者的生存預后分析Figure 2 Prognosis of patients with MCL according to BTK expression level

表2 PFS的單因素和多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analyses of progression-free survival

3 討論

MCL為B-NHL中的一種特殊亞型。兼具惰性與侵襲性的臨床特點，目前暫無標準統一的治療方案。腫瘤細胞中BCR信號通路為持續活化的狀態，BTK為BCR信號通路中的關鍵分子，參與MCL惡性腫瘤發生，而BTK抑制劑ibrutinib的問世顯著改善了MCL患者的療效和預后。

病理組織經BTK抗體染色后發現，BTK在正常淋巴結組織中僅局限在生發中心外套區，而在MCL組織中BTK為彌散性的強陽性表達，特別是高水平表達（≥6分）組中，BTK廣泛的彌漫性強陽性著色并伴生發中心消失。上述結果較好的支持了MCL細胞中BCR信號通路中關鍵靶分子BTK持續活化的理論，即BTK的高表達可能直接反映腫瘤組織中該靶點活化程度高。

BTK表達與MCL患者臨床特征之間相關性分析顯示，BTK的陽性表達與患者的Ki-67和MIPI評分顯著相關，而與性別、年齡、臨床分期、B癥狀、骨髓受累、LDH和血清β2-MG，差異無統計學意義（P＞0.05）。其中Ki-67是一種增殖細胞相關的核抗原，其蛋白表達的強弱反映腫瘤細胞增殖活性高低［11-12］。Ki-67也已作為許多腫瘤，特別是乳腺癌和其他淋巴腫瘤的治療方案選擇的重要參數之一［13-14］。而MIPI則是Hoster等［15］血液學專家根據患者的年齡、ECOG評分、LDH和WBC 4個危險因素進行的預后評估，是目前已應用較為廣泛的MCL預后評價模型。在本次研究中BTK強陽性表達與Ki-67指數和MIPI呈正相關，表明BTK強陽性表達的患者臨床特征會更加具有侵襲性，預后則更差。雖然BTK與Ann Arbor分期、骨髓受累、淋巴結外侵部位的數量無明顯相關性，但值得注意的是在臨床分期為Ⅰ/Ⅱ期患者BTK均為低陽性表達，由于本研究樣本的限制，未能充分說明其統計學差異性。因此，BTK表達與MCL患者臨床特征之間相關性亟需擴大臨床樣本量來進一步驗證說明。

由于MCL異質性的臨床特點，臨床預后評價也顯得尤為重要。本研究中BTK高表達的患者PFS顯著低于BTK低表達患者（P=0.030），而在Cox多因素分析模型中，BTK尚不能作為MCL患者PFS的獨立預后因素（P=0.988）。雖然本研究的預后分析不能充分說明BTK陽性的不良預后作用，但基于小樣本量和短暫的隨訪時間，在白細胞計數、LDH差異無統計學意義時，BTK陽性已是PFS的一項不良預后指標。此外，在其他實體瘤的研究中，已證實BTK的高表達與預后的不良相關性［16］。因此，BTK在MCL的臨床預后評價中也是一項重要的評價因素。

除了患者的基線臨床指標，治療方案的選擇同樣是MCL患者的重要預后因素。但由于本研究中具體的治療方案種類不一，且受樣本量的限制，未給予化療方案的預后評價。但是選擇合適的治療策略前提是敏感的預后指標評價。因此，BTK高表達的MCL患者治療方法的選擇也應給予重視。

綜上所述，BTK蛋白在MCL患者中多為高表達，且與Ki-67和MIPI評分相關；BTK強陽性表達患者的PFS顯著低于BTK弱表達患者（P=0.030），但由于隨訪時間短暫和樣本量限制，BTK的強陽性表達尚不能作為PFS的一項獨立不良預后因素。

[1]O'Connor OA.Mantle cell lymphoma:identifying novel molecular targets in growth and survival pathways[J].Hematology Am Soc He-matol Educ Program,2007,2007(1):270-276.

[2]Vose JM.Mantle cell lymphoma:2015 update on diagnosis,riskstratification,and clinical management[J].Am J Hematology,2015,90(8):739-745.

[3]Kahl BS,Dreyling M,Gordon LI,et al.Recent advances and future directions in mantle cell lymphoma research:report of the 2016 mantle cell lymphoma consortium workshop[J].Leuk Lymphoma,2017,58(7):1561-1569.

[4]Furtado M,Rule S.Indolent mantle cell lymphoma[J].Haematologica,2011,96(8):1086-1088.

[5]Ruan J,Martin P.Which patients with mantle cell lymphoma do not need aggressive therapy[J].Current Hematologic Malignancy Reports,2016,11(3):234-240.

[6]Roskoski R.A historical overview of protein kinases and their targeted small molecule inhibitors[J].Pharma Res,2015,(100):1-23.

[7]Jerkeman M,Hallek M,Dreyling M,et al.Targeting of B-cell receptor signalling in B-cell malignancies[J].J Intern Med,2017.[Epub ahead of print].

[8]Noy A,de Vos S,Thieblemont C,et al.Targeting bruton tyrosine kinase with ibrutinib in relapsed/refractory marginal zone lymphoma[J].Blood,2017,129(16):2224-2232.

[9]Treon SP,Xu L,Hunter Z.MYD88 mutations and response to ibrutinib in waldenstrom's macroglobulinemia[J].New Engl J Medi,2015,373(6):584-586.

[10]Cameron F,Sanford M.Ibrutinib:first global approval[J].Drugs,2014,74(2):263-271.

[11]Gerdes J,Pileri S,Bartels H,et al.Proliferation marker Ki-67:correlation with histological diagnosis,neoplasm grading and clinical course[J].Verh Dtsch Ges Pathol,1986,(70):152-158.

[12]Chihara D,Asano N,Ohmachi K,et al.Ki-67 is a strong predictor of central nervous system relapse in patients with mantle cell lymphoma(MCL)[J].Ann Oncol,2015,26(5):966-973.

[13]Niikura N,Iwamoto T,Masuda S,et al.Immunohistochemical Ki-67 labeling index has similar proliferation predictive power to various gene signatures in breast cancer[J].Cancer Sci,2012,103(8):1508-1512.

[14]Wang M,Wang LR.Reseach progress of Ki-67 in acute myeloid leukemia-review[J].J Exp Hematol,2016,24(4):1264-1268.

[15]Hoster E,Dreyling M,Klapper W,et al.A new prognostic index(MIPI)for patients with advanced-stage mantle cell lymphoma[J].Blood,2008,111(2):558-565.

[16]Zucha MA,Wu ATH,Lee WH,et al.Bruton's tyrosine kinase(Btk)inhibitor ibrutinib suppresses stem-like traits in ovarian cancer[J].Oncotarget,2015,6(15):13255-13268.

BTK expression and its clinical significance in 32 cases of mantle cell lymphoma

Xiaohui JIA,Lingzhe KONG,Xianhuo WANG,Huilai ZHANG

Department of Lymphoma,Sino-US Center for Lymphoma and Leukemia,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Tianjin 300060,China

Huilai ZHANG;E-mail:zhlwgq@126.com

Objective:To detect Bruton tyrosin kinase(BTK)expression in patients with mantle cell lymphoma(MCL)and analyze its correlation with clinical features and prognosis.Methods:A total of 32 cases of MCL tissues and 10 cases of benign lymph nodes were sampled and stained with immunohistochemical(IHC)staining.Clinical data of these patients were analyzed using SPSS 17.0.Results:BTK was positively expressed in MCL and normal lymphoid tissues and was more strongly expressed in MCL tissue than in normal lymphoid tissue.Moreover,BTK expression level was correlated with Ki-67 and MIPI scores.Prognosis analysis showed that patients with high BTK expression exhibited shorter progression-free survival(PFS)than patients with low expression levels(P=0.030);however,no significant difference in overall survival(OS)was observed(P=0.073).Single-factor analysis of PFS showed that age≥65 years,ECOG score≥2,bone marrow involvement,strongly positive BTK expression,Ki-67＞30%,and MIPI score≥6 are poor prognostic factors for patients with MCL.Only MIPI score≥6 is considered an independent poor prognostic factor in the multivariate analysis.Conclusion:BTK is strongly and positively expressed in patients with MCL,and its expression level is correlated with Ki-67 and MIPI scores.Patients with high-level BTK expression usually exhibit shorter PFS than those with low-level BTK expression;however,owing to short follow-up time and limited sample size,high-level BTK expression cannot be considered an independent poor prognostic factor for PFS.

Bruton tyrosine kinase,mantle cell lymphoma,progression-free survival,ibrutinib

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.19.548

天津醫科大學腫瘤醫院淋巴瘤科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫院研究中心（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81402945）資助

張會來 zhlwgq@126.com

This work was supported by National Natural Science Foundation of China(No.81402945)

（2017-05-17收稿）

（2017-07-20修回）

（編輯：孫喜佳 修回：武斌）

賈曉輝 專業方向為淋巴瘤診斷及治療。E-mail：jiaxiaohui201409@126.com