黃秒 綜述 胡啟平 審校

·綜 述·

蛇毒抗腫瘤應用及其機制的研究進展*

黃秒①綜述 胡啟平②審校

蛇毒對多種惡性腫瘤細胞有抑制增殖、誘導細胞凋亡和（或）抑制細胞遷移等作用，且呈劑量效應和（或）時間效應關系；此外，蛇毒還具有抗腫瘤血管生成作用。蛇毒抗腫瘤機制如下：1）通過阻斷某些信號通路抑制腫瘤轉移；2）通過激活死亡信號通路誘導腫瘤細胞凋亡；3）通過調節抑（促）癌基因表達或阻滯細胞周期抑制腫瘤細胞生長和增殖；4）通過抑制腫瘤細胞表達血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）而抑制腫瘤血管生成。蛇毒在抗腫瘤應用方面具有較大的發展空間。本文對近年來國內外蛇毒抗腫瘤應用相關文獻資料進行整理和歸納，總結了蛇毒抗腫瘤作用及其機制，以期為蛇毒抗腫瘤成分的研究、開發和應用提供參考。

蛇毒 抗腫瘤 機制 增殖 遷移 凋亡 血管生成

蛇毒是從毒蛇的毒腺中分泌出來的一種毒液，是最復雜的天然毒性蛋白混合物之一，含有蛋白質、多肽、酶類及其他小分子物質等多種活性成分。隨著藥理學、生物化學、分子生物學的發展，蛇毒的多種活性成分的研究越來越深入，發現蛇毒組分在抗凝［1-2］、鎮痛［3］及抗腫瘤方面具有良好的作用。大量研究報道，蛇毒組分可抑制血管生成［4-5］，對人肝癌［6-7］、乳腺癌［8］、肺癌［9］等10余種腫瘤細胞具有促進凋亡、抑制增殖、抑制遷移［10］等一種或多種作用和效應。本文對近年來國內外實驗中蛇毒組分在抗腫瘤方面的應用及機制的研究進展進行綜述。

1 蛇毒抗腫瘤效應

1.1 蛇毒對腫瘤細胞的影響

1.1.1 蛇毒對腫瘤細胞遷移的影響 一些蛇毒蛋白如agkihpin，是一種從江浙蝮蛇（Agkistrodon halys pallas）蛇毒中提純的精氨酸酯酶，可抑制人肝癌細胞和鼻咽癌細胞的遷移。用不同濃度的agkihpin處理肝癌細胞株后，應用MTT法檢測腫瘤細胞活力，應用細胞計數法檢測agkihpin對細胞遷移的影響。結果顯示,0.207～4.130mg/L劑量的agkihpin對人肝癌SMMC-7721細胞的遷移有明顯的抑制作用，抑制率可達7.8%～98.0%，劑量越大抑制作用越明顯［11］。

1.1.2 蛇毒對腫瘤細胞增殖和細胞周期的影響 一些凝集素、半胱氨酸蛋白酶抑制劑（snake venom cys-tatin，sv-cystatin）、L-氨基酸氧化酶（NA-LAAO）等蛇毒蛋白或多肽可抑制腫瘤細胞增殖、阻滯腫瘤細胞周期。Jebali等［12］研究發現，地中海鈍鼻蝰蛇（Macrovipera lebetina）毒中C型外源凝集素lebecin對乳腺癌細胞MDA-MB231的增殖具有明顯抑制作用，且呈時間及劑量依賴性，并可抑制MDA-MB231細胞依賴于纖維蛋白原和纖連蛋白的遷移。齊元麟等［13］研究發現轉染中華眼鏡蛇（Naja naja actra venom,NNAV）蛇毒中sv-cystatin基因后，在體內外實驗中均對小鼠黑色素瘤細胞B16F1增殖具有抑制作用；NA-LAAO可使人膀胱癌細胞株ECV304細胞阻滯在G1期，并呈量-效關系，同時NA-LAAO對ECV304細胞的生長還有強烈抑制作用，且呈量-效和時-效關系［14］。李映新等［15］發現尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）毒小分子多肽組分對人卵巢癌細胞株A2780的增殖有抑制作用并呈明顯的時-效及量-效關系。

盧康榮等［16］研究發現11種眼鏡蛇毒組分對體外培養的神經膠質瘤細胞U251均有不同程度的生長抑制作用，其中組分KDⅡ-3對腫瘤細胞的抑制作用呈現劑量和時間依賴性。KDⅡ-3還使U251的細胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制U251細胞的增殖。此外，采用7.5 mg/L KDⅡ-3處理U251細胞24 h后，顯示細胞膜皺縮，染色質濃縮、碎裂，透射電鏡觀察顯示細胞核固縮，染色質凝聚。

1.1.3 蛇毒對腫瘤細胞凋亡或壞死的影響 一些蛇毒組分可誘導腫瘤細胞凋亡或殺傷腫瘤細胞，如細胞毒素、凝集素等。王艷等［17］發現眼鏡蛇毒細胞毒素CTX具有較強的毒性作用，在體外可以誘導人肝癌BEL-7404細胞凋亡，且具有明顯的量-效、時-效關系。Aranda-Souza等［18］研究發現，從巴伊亞盾頭蝮蛇（Agkistrodon acutus Bahia）毒提取的凝集素能加快黑色素瘤細胞B16-F10的細胞凋亡。一些粗毒或抑瘤組分對癌細胞有強效殺傷作用或促進凋亡作用，如Song等［19］研究發現，蝰蛇粗毒對卵巢癌PA-1和SK-OV3細胞的增殖有抑制作用，誘導卵巢癌細胞凋亡；Zhang等［20］以眼鏡蛇毒提取物ACTX-6對肺癌A549細胞、周兵等［21］以尖吻蝮蛇毒提取物AAVC-I對小鼠肺癌LLC細胞進行體外實驗，均證實蛇毒組分對肺癌細胞有強效殺傷作用；鄭汝琦等［22］選擇人慢性髓系白血病K562細胞株為實驗對象，發現尖吻蝮蛇毒抑瘤組分1（AVVC-1）可以誘導K562細胞發生凋亡，并由此發揮其抗腫瘤活性。

1.1.4 蛇毒對腫瘤細胞的綜合影響 一些蛇毒蛋白組分對腫瘤細胞的作用包括抑制增殖、誘導凋亡和（或）抑制遷移等多方面。100 μg/mL蛇毒金屬蛋白酶bothropoidin處理人乳腺癌MDA-MB-231細胞24 h后，30%癌細胞被殺滅；10、40 μg/mL的bothropoidin均對細胞早期凋亡和晚期凋亡有明顯的促進作用。此外，這種毒素不僅以劑量依賴方式抑制MDA-MB-231細胞的黏附，還使細胞遷移能力下調45%［4］。NNAV組分對乳腺癌MCF-7細胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈時間及劑量依賴性，NNAV處理后細胞出現形態不規則，部分細胞變圓甚至脫落、細胞破碎等改變，且可以誘導細胞凋亡［23］。Sv-cystatin重組蛋白體外實驗，可在轉錄水平和蛋白水平下調人肝癌MHCC97H細胞轉化生長因子-β2、腫瘤壞死因子α的表達，從而發揮多方面的抗腫瘤作用［24］。Agkihpin可通過下調多藥耐藥蛋白1、環氧合酶2表達及上調表皮鈣黏素表達來抑制人肝癌SMMC-7721細胞［25-27］的活力、增殖和遷移。沙漠眼鏡蛇（Walterinnesia aegyptia）毒MEV與二氧化硅納米粒子NP聯合（MEV+NP）體內外均能持續有效抑制乳腺癌、前列腺癌、多發性骨髓瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡［27］。NNAV在體外可明顯抑制白血病K562/ADM細胞和原代初發難治性急性髓性白血病細胞增殖，并誘導細胞凋亡［28］。

1.2 蛇毒對腫瘤血管生成的影響

腫瘤的生長和轉移依賴于血管生成，內皮細胞的侵襲和遷移是調節腫瘤進展的主要方式。Bothropoidin可降低內皮細胞的活力和黏附性，抑制堿性成纖維細胞生長因子誘導的體外血管生成，表明bothropoidin具有抗血管生成作用［4］。蛇毒去整合素lebein降低P53依賴性結腸腺癌LS174細胞黏附和遷移，并抑制VEGF誘導的鵪鶉胚胎CAM系統中新生血管形成，阻斷裸鼠中人結腸腺癌的發生［29］。Jang等［30］報道蛇毒去整合素saxatilin抑制人肺癌細胞NCI-H460的血管生成特性。NCI-H460細胞培養上清液能夠誘導人臍靜脈血管內皮細胞侵襲和血管形成，而saxatilin處理的癌細胞培養上清液的血管生成活性被削弱。Markland等［31］發現南部銅斑蛇（Agkistrodon contortrix）毒去整合素contortrostatin（CN）可有效阻斷人卵巢上皮癌OVCAR-5細胞黏附于多種細胞外基質蛋白，并抑制腫瘤細胞通過人工基底膜；進一步對OVCAR-5荷瘤小鼠模型進行腫瘤擴散和抗血管生成作用研究，發現腹腔注射CN不僅顯著抑制裸鼠卵巢癌的擴散，而且顯著地防止了繼發部位腫瘤血管的招募。

2 蛇毒組分抗腫瘤的機制

2.1 通過抑制Wnt/β-catenin通路來抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲

本課題組通過實時定量PCR、Western blot、生物信息學技術和酶活性分析研究發現，agkihpin可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路介導的上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）來抑制肝癌細胞的轉移和侵襲。EMT是癌轉移和侵襲的起始步驟和主要表型，agkihpin作用后肝癌細胞SMMC-7721和HepG 2中上皮細胞標志物E-cadherin表達上調，間質細胞標志物N-cadherin和Vimentin、轉錄調節因子Snail和twist表達下調，表明agkihpin可逆轉EMT；經典的Wnt/β-catenin通路是EMT的起始信號之一，agkihpin作用后肝癌細胞中FZD7和β-catenin表達下調、GSK3β（Ser9）磷酸化和β-catenin核沉積減少，從而使Wnt/β-catenin通路抑制。因此，本課題組提出假說，agkihpin通過降解FZD7抑制Wnt/β-catenin通路，導致TCF/LEF轉錄因子失活，進而使EMT逆轉，最終減弱肝癌細胞的轉移和侵襲（圖1），該研究為蛇毒精氨酸酯酶（SVAEs）在肝癌控制的分子機制方面提供新見解，并提高了agkihpin用于肝癌治療的可能性［6］。

圖1 肝癌細胞中agkihpin通過降解FZD7抑制經典Wnt/β-catenin信號通路示意圖［6］Figure 1 Schematic diagram of agkihpin inhibiting canonical Wnt/βcatenin signaling by degradating FZD7 in liver cancer cell［6］

2.2 通過調節抑（促）癌基因表達或阻滯細胞周期來抑制腫瘤細胞增殖

蛇毒組分抑制腫瘤細胞增殖主要通過兩個途徑：1）上調抑癌基因表達與下調促癌基因表達。Sv-cystatin基因轉染可影響小鼠黑色素瘤B16細胞的蛋白質表達譜。實時定量PCR結果顯示，sv-cystatin轉染后抑癌基因NM23、RhoGDI-beta、RANBP1的mRNA表達上調，eif5A、eEF1-beta2、MDH1表達下調。Sv-cystatin的作用靶分子主要定位于細胞外周、質膜和細胞核，與轉錄、半胱氨酸蛋白酶活性、細胞凋亡有關［13］；2）阻滯細胞周期。采用實時定量PCR和Western blot分析NA-LAAO對ECV304細胞周期的影響，發現NA-LAAO可使ECV304細胞阻滯在G1期，并呈量-效關系。cyclin A2、B1、D1、E1、CDK2、CDK6、survivin、skp2表達下調，P21、P16、P27的表達上調［14］。盧康榮等［16］采用流式細胞術檢測細胞周期發現11種眼鏡蛇毒組分對體外培養的神經膠質瘤細胞U251均有不同程度的生長抑制作用，其中KDⅡ-3使U251細胞阻滯在G0/G1期。

2.3 通過激活線粒體死亡途徑誘導腫瘤細胞凋亡

細胞毒素等蛇毒組分可誘導腫瘤細胞凋亡，其主要機制是激活線粒體死亡途徑。王艷等［17］研究發現，CTX通過線粒體細胞色素C（cytochrome C，cyt-C）釋放到細胞質內，進一步誘導效應性caspase-3激活，活化的caspase-3引起caspase級聯反應，完成人肝癌BEL-7404細胞凋亡和清除過程；Song等［19］和趙燦國等［23］研究發現NNAV和蝰蛇毒可分別誘導乳腺癌、卵巢癌細胞凋亡，其機制都可能與下調Bcl-2、上調Bax和caspase-3蛋白表達有關；Aranda-Souza等［18］和鄭汝琦等［22］分別研究發現，巴伊亞盾頭蝮蛇毒凝集素和AVVC-1使腫瘤細胞線粒體膜電位、cyt-C蛋白表達量明顯下降，伴隨胞質內cyt-C的熒光強度增強。結果表明，上述兩種組分可以促使cyt-C的釋放并激活線粒體死亡途徑，從而誘導人慢性髓系白血病K562細胞和黑色素B16-F10細胞發生凋亡，并由此發揮其抗腫瘤活性。

2.4 通過調節腫瘤細胞增殖、凋亡和遷移的關鍵蛋白表達發揮多方面的抗腫瘤作用

Agkihpin、sv-cystatin以及一些粗毒如沙漠眼鏡蛇毒和NNAV，具有抑制腫瘤細胞增殖和遷移、促進腫瘤細胞凋亡等多重功能，其機制可能與該蛇毒或蛇毒組分可調節腫瘤細胞增殖、凋亡和遷移的關鍵蛋白表達有關。

粗毒影響腫瘤細胞分子表達的范圍更廣。MEV能持續有效地抑制乳腺癌、前列腺癌、多發性骨髓瘤等細胞的增殖和遷移、促進細胞凋亡，其機制包括下調轉移趨化因子表達、抑制IGF-1、EGF的表達、增加caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性，減少AKT、ERK、IκBα磷酸化，減少cyclin D1表達、增加cyclin B1表達，改變細胞膜電位，上調Bak、Bax、Bim蛋白表達等多個方面［27］。NNAV在體外可明顯抑制K562/ADM細胞和原發難治性急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）細胞增殖；調節細胞周期停滯于G0/G1期，減少G2/M期的細胞數量，提示NNAV有可能通過干預Bcl-2、caspase-3表達而誘導細胞凋亡。調節細胞周期進程可能是NNAV組分抑制原發難治性AML細胞增殖的作用機制［28］。

2.5 蛇毒抑制癌細胞表達VEGF抑制腫瘤血管生成

腫瘤的生長和轉移依賴于病理性內皮細胞侵襲和遷移基礎上的血管生成。不同蛇毒組分抑制內皮細胞侵襲和遷移的機制不盡相同，蛇毒去整合素的抑血管生成活性可能與其阻斷Akt和ERK1/2信號通路抑制癌細胞表達VEGF有關。Lebein通過誘導活性氧觸發蛋白激酶ERK1/2途徑激活，明顯減少LS174細胞表達VEGF和神經纖毛蛋白1等兩種血管生成刺激因子；此外，Lebein通過下調整合素α5β1表達降低LS174細胞黏附和遷移［29］。Jang等［30］研究報道蛇毒去整合素saxatilin抑制NCI-H460細胞的血管生成誘導特性。進一步的實驗數據表明，saxatilin通過阻斷Akt信號通路下調缺氧誘導因子-1α來抑制NCI-H460細胞分泌VEGF。蛇毒去整合素抑制內皮細胞侵襲和遷移的分子基礎對開發新的抗血管生成藥物并應用于癌癥治療具有重要意義。

3 結語

綜上所述，近年來國內外明確的證據表明多種蛇毒或蛇毒蛋白（肽）對多種惡性腫瘤細胞具有明顯的抑制增殖和遷移、誘導細胞凋亡等作用，且呈量-效和時-效關系。歸納蛇毒的抗腫瘤作用機制如下：1）通過抑制某些信號通路來抑制腫瘤侵襲和轉移（如精氨酸酯酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、凝集素）；2）通過激活死亡途徑誘導腫瘤細胞凋亡（如半胱氨酸蛋白酶抑制劑、細胞毒素、L-氨基酸氧化酶等）；3）通過調節抑（促）癌基因表達或阻滯細胞周期來抑制腫瘤細胞生長和增殖（如半胱氨酸蛋白酶抑制劑、氨基酸氧化酶）；4）通過調節腫瘤細胞增殖、凋亡和遷移的關鍵蛋白表達發揮多方面的抗腫瘤作用（如精氨酸酯酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑等）；5）通過抑制癌細胞表達VEGF而抑制腫瘤血管生成（如去整合素、金屬蛋白酶）。

國內外學者對蛇毒抗腫瘤的研究已經取得了較多的成果，對蛇毒抗腫瘤作用機制研究仍是目前的熱點，由于蛇毒成分復雜、生化性狀各異，不同蛇種、亞種、甚至同一蛇種不同季節所分泌的毒液，其毒性成分均存在一定的差異，故對蛇毒內單一組分的結構和理化性質、蛇毒抗腫瘤的安全有效劑量和不良反應需要深入研究。此外，蛇毒抗腫瘤研究和應用還面臨單一組分在蛇毒中含量少、分離技術難度大、成本高，臨床用量和實驗室用量大，自然蛇毒隨環境惡化日漸短缺等問題，希望將來能夠通過分子克隆技術生產大量活性強、純度高的重組蛇毒蛋白。目前，蛇毒的抗腫瘤作用在臨床中還僅處于試用階段，大部分還停留在實驗室研究階段。希望蛇毒抗腫瘤研究和應用能早日應用于臨床，更好地造福腫瘤患者。

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Advances in the research on application and antitumor mechanism of snake venom

Miao HUANG1,Qiping HU2

1Radiology Department,Affiliated Tumor Hospital Guangxi Medical University,Nanning 530021,China,2Department of Cell Biology and Genetics,School of Pre-clinical Medicine,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

Qiping HU;E-mail:huqiping@gxmu.edu.cn

Recent literatures on antitumor effect,mechanism,and application of snake venom were summarized.This study aimed to provide a basis for the research,development,and application of snake venom which includes antitumor components.The abilities of snake venom was found in inhibiting tumor proliferation and migration and/or inducing apoptosis in a variety of malignant tumor cells at dose-dependent and/or time-dependent manner.Some types of snake venom inhibit tumoral angiogenesis.Meanwhile,the antitumor mechanisms of snake venom were as follows:1)inhibit tumor metastasis by blocking certain signaling pathways,2)induce apoptosis of tumor cells by activating the death pathway,3)inhibit growth and proliferation of tumor cells by regulating the expression of tumor suppressor(promoter)genes or arresting the cell cycle,and 4)inhibit tumoral angiogenesis by inhibiting the expression of VEGF from cancer cells.Thus,snake venom has potential as an antitumor agent.

snake venom,antitumor,mechanism,proliferation,migration,apoptosis,angiogenesis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.19.143

①廣西醫科大學附屬腫瘤醫院影像學診斷中心（南寧市530021）；②廣西醫科大學基礎醫學院細胞生物學與遺傳學教研室

*本文課題受廣西衛生廳項目（編號：Z2015602）和廣西自然科學基金項目（編號：2014GXNSFAA118172）資助

胡啟平 huqiping@gxmu.edu.cn

This work was supported by Research Project of the Guangxi Health and Family Planning Commission(No.Z2015602)and Natural Science Foundation of Guangxi Province(No.2014GXNSFAA118172)

（2017-02-13收稿）

（2017-08-30修回）

（編輯：武斌 校對：鄭莉）

黃秒 專業方向為腫瘤影像學診斷和蛇毒蛋白抗癌效應的基礎研究。

E-mail：miaomi6660@sina.com