ZDS基因干擾表達對煙草類胡蘿卜素生物合成的影響

江露++班秋麗++汪善良

摘要 煙草類胡蘿卜素對煙葉品質和可用性有重要作用，ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）是調控類胡蘿卜素合成積累的關鍵酶之一。為研究ZDS基因干擾表達對煙草類胡蘿卜素生物合成的影響，從貴州省煙草科學研究院福泉試驗基地取樣品，采用不同株系相同部位的方式取樣，與貴煙1號（GY1）對照，篩選出能夠構建RNA干擾（RNAi）載體并成功轉化的轉基因植株，建立ZDS基因的SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR的檢測方法，檢測新鮮煙葉中ZDS基因表達水平并分析其遺傳表型的變化。結果表明，ZDS和其他類胡蘿卜素合成關鍵酶基因的表達均下調，其遺傳后代出現異于正常植株的白化與矮化的表型。證明了ZDS基因對產生這種異同發揮了作用，也充分佐證了RNAi技術在基因功能分析中有著重要的作用，但這些樣品表現出白化和矮化的表型是否是由于煙草類胡蘿卜素的合成受到抑制尚不確定，還需要進一步驗證。

關鍵詞 煙草類胡蘿卜素；ZDS基因；實時熒光定量PCR；RNA干擾

中圖分類號 Q786 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）20-0231-03

Effects on Tobacco Carotenoid Biosynthesis of Expression of ZDS Gene Interference

JIANG Lu BAN Qiu-li WANG Shan-liang

（Guizhou Anweitian Detecting Technology Co.，Ltd.，Guiyang Guizhou 550009）

Abstract Tobacco carotenoids had an important effect on leaf quality and availability.ζ-carotene desaturase（ZDS）was a key enzyme in the regulation of carotenoid biosynthesis.In order to study the interference of ZDS gene expression of carotenoid biosynthesis in tobacco，this paper took samples from Fuquan test base of Guizhou Provincial Academy of Tobacco Science，using different strains of the same parts of the sampling methods，scalding out the transformed transgenic plants of RNA interference（RNAi）vector from tobacco on the 1st（GY1）.ZDS gene SYBR Green I RTFQ RT-PCR test method was built for detecting fresh tobacco leaves ZDS gene expression levels and phenotypic analysis of genetic variation.The results showed that ZDS and other carotenoid synthesis gene expression of key enzymes decreased，and their genetic offspring albino and dwarf phenotype were different from normal plants. It proved that ZDS genes played a key role in those similarities and differences，and it also demonstrated that the RNAi technology played an important role in the analysis of gene function.But it was not sure that the albino and dwarf phenotype of these samples was due to carotenoid synthesis inhibited in tobacco and it needed further validation.

Key words tobacco carotenoid；ZDS gene；RTFQ RT-PCR；RNA interference

植物類胡蘿卜素主要分布在植物葉綠體和有色體膜中，而新鮮煙葉中的類胡蘿卜素主要有葉黃素、新黃質、紫黃質和β-胡蘿卜素。類胡蘿卜素作為許多重要的香味成分的前體，在煙味的形成過程中起著重要的作用[1-4]。高等植物類胡蘿卜素生物合成途徑包括異戊二烯焦磷酸生物合成、八氫番茄紅素生物合成、番茄紅素生物合成、胡蘿卜素生物合成、葉黃素生物合成和蘿卜素裂解等過程[5]。由圖1可知，異戊烯焦磷酸異構酶（IPP）、牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶（GGPS）、八氫番茄紅素合成酶（PSY）、八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）、番茄紅素β環化酶（LCYB）、番茄紅素ε環化酶（LCYE），其均位于類胡蘿卜素合成途徑中生成α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的基因上游，其中某一個基因表達異常并不能說明整個類胡蘿卜素合成代謝途徑異常甚至終止。因此，在研究某一個基因表達情況時，往往需要考慮其他上下游基因表達的情況。

基因表達，即DNA到蛋白質的過程。其中，蛋白質由mRNA編碼而成，利用實時熒光定量RT-PCR[6-9]對其進行定量分析以獲取其基因表達水平。而對于基因表達調控，通過RNA干擾[10-11]（RNAi）載體構建人為引入與內源靶基因具有相同序列的非正常雙鏈RNA（dsRNA），從而誘導內源靶基因mRNA降解，達到阻止基因表達的目的，使細胞出現靶基因缺失的表型，引發植物RNA沉默，主要有轉錄水平的基因沉默（TGS）和轉錄后水平的基因沉默（PTGS）。而PTGS在植物基因研究中有著極其重要的應用，比如植物基因功能分析、作物品種改良、抗病蟲和抗逆性等方面[12]。在多種植物如水仙、小麥和草莓中都有ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的相關研究報道[13-15]，通過基因表型變化，鑒定該基因功能，而有關煙草中ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因特性與RNAi引起的基因沉默尚未見報道。因此，本研究針對ZDS基因干擾在煙草類胡蘿卜素中的表達情況，建立高效可控的SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測法，準確定量地檢測ZDS基因表達水平，對研究煙草類胡蘿卜素的生物合成具有重要意義。endprint

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通過TaKaRa 公司PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synt-hesis Kit試劑盒提取的煙草cDNA模板，SYBR Premix Dimer Eraser（50×），上下游引物，ROX I，滅菌水，冰塊，量程1 mL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2.5 μL的Eppendorf 移液槍及槍頭，ABI公司Stepone，微孔板迷你離心機，迷你離心機，一次性醫用橡膠手套與口罩，記號筆。

1.2 試驗方法

參照煙草基因ZDS全序列[15]和IPP、LCYE、LCYB、內參基因Gene21的全序列，用Primer Premier V5.0軟件設計引物，引物序列見表1。

使用Stepone時，設置RT-PCR反應系統為SYBRR Green Reagents，定量方法為Quantitation-Comparative Ct（ΔΔCt），程序運行速度為標準Standard，模板類型選擇cDNA。各 cDNA 樣品分別以ZDS、IPP、LCYE、LCYB和 Gene21引物進行定量PCR反應。反應體系為20 μL：SYBR Premix Dimer Eraser（50×）10 μL，上下游引物分別為0.6 μL，ROX I 0.4 μL，cDNA模板1 μL，滅菌水7.4 μL。反應程序采用三步法：95 ℃預變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s（收集信號），72 ℃延伸30 s，40次循環，溶解曲線條件為95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s（收集信號）。每個PCR反應重復2次，并且設立空白對照和非轉基因GY1的對照組。在每一循環的退火階段收集熒光信號以便進行實時檢測。反應結束后得到含有所有標本的記錄點曲線。在調整Baseline cycles和計算 Threshold value（閾值）后，得出循環閾值Cycle threshold （即Ct值）。

2 結果與分析

2.1 檢測基因表達的準確性

樣品在熒光定量 PCR 儀上擴增后，得到1條反映核酸擴增ZDS基因過程的S形熒光定量動力學曲線（圖2）。用循環閾值（Ct）作為臨界點，該點位于PCR產物消除熒光背景后進入指數擴增期的開始點。可以看出，熒光定量動力學曲線基線平整，指數區斜率較大且比較平滑，擴增曲線比較理想。同時，空白對照組一直保持水平線，無引物二聚體產生。

對于基因表達的準確性還必須注意到熒光PCR產物的溶解曲線，用于判斷產物是否相對專一。溫度升高使雙鏈PCR產物解鏈，以致于不能與熒光染料SYBR Green I分子結合，熒光信號減弱。剛開始升溫時熒光信號變化不大，當溫度接近解鏈溫度時，信號變化過大而出現了峰值。再加熱，雙鏈PCR產物解鏈，所以幾乎是平的，接近解鏈溫度Tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。在加熱過程中出現一些比較矮、寬的峰（圖3），這是由于非特異性產物的影響，因而這一試驗數據就不能采用。若是陰性對照GY1出現非特異性產物，那么這一樣品就不能作為對照，在Stepone的分析中換成溶解曲線正常的對照。圖4為熒光PCR產物的溶解曲線，同一引物Tm值較穩定，有一些矮但并不寬的峰，非特異性產物不明顯，基因表達結果能夠說明問題。

2.2 檢測基因表達的重現性

為了驗證該技術方法的重復性，以同一個cDNA樣品為例進行重復測定，2次重復的誤差和變異系數都較小（表2）。同時從圖2的S型熒光定量曲線也可看出，曲線的重復性和穩定性很好，在擴增前期，特別是在閾值附近，同一樣品的曲線基本是重疊的，擴增后期即進入平臺期后曲線仍比較平穩，符合S型。

2.3 ZDS基因干擾表達對煙草類胡蘿卜素生物合成的影響

不同樣品對煙草ZDS基因表達的影響如圖5所示，其中Gene21為內參基因，GY1為非轉基因對照組。誘導ZDS 基因在mRNA轉錄水平上的表達結果顯示，樣品140-7和140-10對 ZDS基因表達均明顯下調，而IPP、LCYE、LCYB也同時表達下調。由圖1 植物煙草類胡蘿卜素的生物合成途徑可知，IPP、ZDS、LCYE、LCYB均為參與煙草類胡蘿卜素生物合成的重要酶之一，其中一個受到干擾，都會影響類胡蘿卜素的生物合成。IPP位于ZDS的基因上游，LCYE和LCYB位于ZDS的基因下游，若ZDS基因表達下調，那么IPP基因表達的產物就會不斷積累，產生負反饋調節，最終抑制了上游產物異戊烯焦磷酸的合成，而出現 IPP基因表達下調的情況。此外，ZDS基因表達受限，導致產物番茄紅素含量下降，而番茄紅素分別在LCYE和LCYB這2種酶的作用下生成α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的這一代謝效率降低，產生正反饋調節，最終也抑制了α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素酶的合成，而出現LCYE和LCYB基因表達下調的情況。若這種猜測成立，將更好地解釋分子生物學中基因沉默的規律變化。

從圖5還可看出，樣品140-7的基因相對表達量較 140-10的相對表達量低，說明干擾載體對140-7的ZDS基因的干擾效率較140-10的高。通過RNAi載體構建得到的煙草轉基因陽性植株，其種子在營養基質中播種后，與對照樣品GY1比較，140-7出現大面積的白化和矮化表型，140-10出現部分的白化，矮化暫不明顯（圖6）。由此表明，通過RNAi這一技術降低煙草中ZDS基因的表達后，使得其與正常植株相比表現出了異同，證明ZDS對產生這種異同發揮了作用。3 結論與討論

采用SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR展開ZDS基（下轉第235頁）

（上接第233頁）

因干擾表達試驗，結果表明，ZDS基因表達下調，其他關鍵酶基因也隨之下調，說明ZDS基因干擾表達能夠影響煙草類胡蘿卜素的生物合成。通過RNAi這一技術使得煙草中ZDS基因的表達水平降低，出現了異于正常植株的表型變化，證明了ZDS對產生這種異同發揮作用。本試驗定量檢測了ZDS基因干擾表達對煙草類胡蘿卜素的生物合成的影響，對闡明煙草類胡蘿卜素中致香前體物合成途徑所需的關鍵酶基因表達以及功能具有重要的借鑒作用。endprint

4 參考文獻

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